車勇良，陳秋勇，陳如敬，吳學(xué)敏，王隆柏，劉玉濤，周倫江

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

吲哚放線桿菌(Actinobacillusindolicus，A.indolicus)是附著于豬上呼吸道的一種常在菌[1]，該菌與小放線桿菌(Actinobacillusminor)、豬放線桿菌(Actinobacillusporcinus)共屬于其他NAD依賴性巴氏桿菌科成員[2-4]。NAD依賴性巴氏桿菌科成員包括副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和其他NAD依賴性巴氏桿菌科成員[4]。據(jù)報(bào)道，吲哚放線桿菌與豬的卡他性肺炎和纖維蛋白滲出性肺炎有一定關(guān)系，能引起豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失[1]。遺傳進(jìn)化樹顯示，NAD依賴性巴氏桿菌科各成員間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一，吲哚放線桿菌和副豬嗜血桿菌的親緣關(guān)系最近[4-7]。

目前，仍然有大量的抗生素被用來治療豬的呼吸道疾病，因此，多重耐藥菌和泛耐藥菌在全世界范圍內(nèi)還在迅速攀升。氟苯尼考作為一種常用的治療豬呼吸道疾病的藥物，已經(jīng)導(dǎo)致了大量耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。floR基因是一種氟苯尼考耐藥基因，廣泛存在于各種細(xì)菌基因組或質(zhì)粒中，其中也包括副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的基因組或質(zhì)粒[8-12]，但在吲哚放線桿菌的質(zhì)粒中還是首次被發(fā)現(xiàn)。

迄今，尚未有吲哚放線桿菌的全基因組序列測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究從發(fā)病豬的肺臟中分離到1株多重耐藥細(xì)菌，通過16S rRNA的PCR鑒定細(xì)菌種類、全基因組序列測(cè)定、并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以研究該菌株的部分生物學(xué)特性并探究其耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 菌株AIFJ1607分離自福建省某豬場(chǎng)患呼吸道疾病并死亡的保育豬肺臟，分離時(shí)間：2016年7月。

1.1.2試劑和儀器 Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；核酸抽提試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；細(xì)菌培養(yǎng)基TSA和TSB購(gòu)自BD Difco公司；輔酶NAD購(gòu)自Roche公司；無菌脫纖馬血、各種藥敏紙片和藥敏試劑購(gòu)自溫州康泰生物科技公司；PCR儀從Eppendorf公司購(gòu)買。

1.2 細(xì)菌分離鑒定無菌采集死亡豬的肺臟，用手術(shù)刀片分離肺臟的外膜并劃開肺臟組織，接著用無菌接種環(huán)插入肺臟組織內(nèi)部，拿出后劃線接種于TSA培養(yǎng)板(含0.005%的NAD和5%的無菌脫纖馬血)，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌落形態(tài)并挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。并將可疑單菌落繼續(xù)接種于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至菌落形態(tài)大小均一、色澤一致為止。

挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基(含0.005%NAD和5%犢牛血清)，置于振蕩器37℃200 r/min振搖18～24 h，應(yīng)用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取該細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

合成細(xì)菌16S rRNA的通用引物27 F和1 492 R[13-16]，加樣劑量為PCR Mix 12.5 μL，無菌水9.5 μL，上游引物(20 mg/L)0.5 μL，下游引物(20 mg/L)0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，共25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min;94℃ 40 s，52℃ 40 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。送PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI的BLAST比較，分析同源性比對(duì)結(jié)果。

1.3 細(xì)菌生化分析生化試驗(yàn)按照生化鑒定管說明書進(jìn)行操作，對(duì)細(xì)菌的吲哚活性[2]、脲酶和過氧化氫酶活性[5]、NAD依賴性[17]、溶血特性、cAMP試驗(yàn)等進(jìn)行分析。

1.4 藥敏試驗(yàn)及最小抑菌濃度(MIC值)測(cè)定應(yīng)用K-B紙片藥敏實(shí)驗(yàn)法[18]，即用接種針挑取分離的細(xì)菌涂布于TSA(含0.005%的NAD和5%的無菌脫纖馬血)培養(yǎng)板中，選擇藥敏紙片粘貼于培養(yǎng)基上，放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌25922株。同時(shí)，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)[19]的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用微量肉湯稀釋法測(cè)定20種抗生素的MIC值。

1.5 細(xì)菌質(zhì)粒的提取及序列測(cè)定用接種針挑取分離的細(xì)菌涂布于TSB(含0.005%的NAD和5%的無菌脫纖馬血)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振搖12～16 h，細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(D600=0.6)，離心收集細(xì)菌沉淀，應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒按照說明書提取細(xì)菌質(zhì)粒。質(zhì)粒應(yīng)用耐藥基因floR的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)[20]，并且把質(zhì)粒送廣州基迪奧基因測(cè)序公司進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。

1.6 細(xì)菌全基因序列測(cè)定及分析用接種針挑取分離的細(xì)菌涂布于TSB(含0.005%的NAD和5%的無菌脫纖馬血)液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振搖12～16 h，細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(D600=0.6)，離心收集細(xì)菌沉淀,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取高質(zhì)量的DNA并構(gòu)建DNA文庫(kù)，應(yīng)用Pacific Biosciences公司研發(fā)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)的第三代測(cè)序儀PacBio RSⅡ進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。根據(jù)要求，應(yīng)用多種軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行基因組組裝和進(jìn)行生物信息學(xué)分析。耐藥基因通過抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD搜索獲得。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定豬肺臟接種TSA血平板在37℃倒置培養(yǎng)過夜后，血平板上出現(xiàn)圓形、半透明、濕潤(rùn)、邊緣整齊的微小菌落(圖1)。革蘭染色后顯示為微小球狀、短球桿狀或絲狀的革蘭陰性細(xì)菌(圖2)。生化試驗(yàn)顯示該細(xì)菌生長(zhǎng)需要NAD或X因子的參與，過氧化氫酶和吲哚為陽(yáng)性，尿素酶和cAMP試驗(yàn)為陰性，是一種不溶血的細(xì)菌。16S rRNA序列的同源性結(jié)果顯示該細(xì)菌與吲哚放線桿菌46KC2株的序列同源性達(dá)到99%。因此，把該細(xì)菌命名為吲哚放線桿菌AIFJ1607株(ActinobacillusindolicusAIFJ1607)(圖3)。

圖1 吲哚放線桿菌菌落

圖2 吲哚放線桿菌革蘭染色

圖3 5種不同細(xì)菌間的16S rRNA遺傳進(jìn)化樹分析

2.2 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)與MIC測(cè)定K-B藥敏紙片和MIC試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對(duì)以下這些抗生素均耐藥，分別為慶大霉素、妥布霉素、大觀霉素、鏈霉素、新霉素、卡那霉素、青霉素、頭孢、氯霉素、氟苯尼考、磺胺、四環(huán)素、博萊霉素、甲硝唑和恩諾沙星等；該細(xì)菌對(duì)泰妙菌素、亞胺培南、替米考星、林可霉素和利福平等抗生素敏感(表1)。

表1 用K-B紙片法和MIC法所進(jìn)行的藥物敏感性試驗(yàn)

2.3 細(xì)菌全基因組序列分析細(xì)菌全基因組DNA序列經(jīng)測(cè)定、拼接和組裝后，Subread數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示number of reads為99 623，Reads of N50為9 054。細(xì)菌基因組序列全長(zhǎng)為2 251 645 bp，GC含量為40.12%，有2 162個(gè)編碼序列，58個(gè)tRNA序列，19個(gè)rRNA序列，1個(gè)CRISPR序列和36個(gè)重復(fù)序列(表2)。

表2 吲哚放線桿菌AIFJ1607株的基因組序列基本信息

根據(jù)COG注釋，87.6%(1 894/2 162)的編碼序列可分為22項(xiàng)COG，主要分為3類(圖4)：信息存儲(chǔ)與加工，細(xì)胞過程和信號(hào)代謝。其中，231條編碼序列被注釋為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，272條編碼序列被注釋為僅一般功能預(yù)測(cè)，8條編碼序列被注釋為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，3條編碼序列被注釋為細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和1條編碼序列被注釋為RNA加工和修飾。圈圖展示了細(xì)菌基因組序列中COG類別的分布特征(圖4，5)。

圖4 吲哚放線桿菌AIFJ1607株基因組序列的COG功能

圖5 吲哚放線桿菌AIFJ1607株基因組序列的COG功能圈圖

2.4 細(xì)菌耐藥基因及插入序列分析與抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD中的耐藥基因進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)耐藥基因島，包括13種耐藥基因，分別為aph33ib、aac(3)-Ⅱa、aph6id、aph3ia、ant3ia、ble、NimC/NimA、arsR、tetB、norA、blaROB-1、sul2和cat3，其分別對(duì)應(yīng)以下抗生素：鏈霉素(aph33ib、aph6id和ant3ia)、慶大霉素(aac(3)-Ⅱa和aph3ia)、萘替米星(aac(3)-Ⅱa)、地貝卡星(aac(3)-Ⅱa)、妥布霉素(aac(3)-Ⅱa)、西索米星(aac(3)-Ⅱa)、新霉素(aph3ia)、卡那霉素(aph3ia)、核糖霉素(aph3ia)、巴龍霉素(aph3ia)、里杜霉素(aph3ia)、壯觀霉素(ant3ia)、青霉素(blaROB-1)、頭孢菌素(blaROB-1)、博萊霉素(ble)、甲硝唑(NimC/NimA)、砷抑制劑(arsR)、四環(huán)素(tetB)、喹諾酮類抗生素(norA)、磺胺類抗生素(sul2)、氯霉素類抗生素(cat3)(表3、圖6)。

表3 吲哚放線桿菌AIFJ1607株的抗生素耐藥基因、 相對(duì)應(yīng)的基因編號(hào)及抗生素

同時(shí)，通過與GenBank中的插入序列(IS)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)在該耐藥基因島中有多種插入序列，分別為IS6、IS10、IS30、ISApl1和ISAbal4(圖6)。

圖6 吲哚放線桿菌AIFJ1607株的耐藥基因島

2.5 細(xì)菌質(zhì)粒全基因序列分析通過提取該細(xì)菌質(zhì)粒，獲得了2種質(zhì)粒，分別命名為pAIFJ1和pAIFJ2，全基因組序列分析結(jié)果顯示質(zhì)粒pAIFJ1的基因組全長(zhǎng)為5 087 bp，包括floR、lysR和repB基因(圖7)；質(zhì)粒pAIFJ2的基因組全長(zhǎng)為2 626 bp，包括repB基因和2個(gè)假定蛋白基因。PCR結(jié)果表明可從質(zhì)粒pAIFJ1中擴(kuò)增出floR基因的目的片段(圖8)。同源性分析結(jié)果顯示質(zhì)粒pAIFJ1與副豬嗜血桿菌中分離得到的質(zhì)粒pHPSGC具有很高的同源性(圖9)。

圖7 質(zhì)粒pAIFJ1圈圖

M.DL2000 DNA Marker;1～2.floR基因

圖9 3種質(zhì)粒pHPSGC、pAIFJ1和pHPSF1的同源性比較圖

2.6 基因序列的登錄號(hào)吲哚放線桿菌16S rRNA的基因序列登錄號(hào)為MF179617.1，吲哚放線桿菌全基因組序列登錄號(hào)為CP038145.1，質(zhì)粒pAIFJ1的全基因組序列登錄號(hào)為MF678833.1。

3 討論

該分離菌株AIFJ1607與GenBank中登錄的吲哚放線桿菌16S rRNA基因序列的同源性高達(dá)99%，生化鑒定的結(jié)果顯示該細(xì)菌生長(zhǎng)需要NAD或X因子的參與，過氧化氫酶和吲哚為陽(yáng)性，尿素酶和cAMP試驗(yàn)為陰性，是一種不溶血的細(xì)菌，這些結(jié)果與吲哚放線桿菌的16S rRNA、生化鑒定結(jié)果一致[2-4]。因此，該分離菌株AIFJ1607被鑒定為吲哚放線桿菌。

通過細(xì)菌基因組耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)耐藥基因島，包含有氨基糖苷類抗生素耐藥基因5種、博來霉素耐藥基因1種、四環(huán)素類耐藥基因1種、喹諾酮類抗生素耐藥基因1種、頭孢類抗生素耐藥基因1種、磺胺類抗生素耐藥基因1種、氯霉素類抗生素耐藥基因1種、硝基咪唑類抗生素耐藥基因1種和砷抑制劑基因1種等9種耐藥基因。這些與該菌株的藥敏試驗(yàn)和MIC試驗(yàn)的結(jié)果一致。這進(jìn)一步表明吲哚放線桿菌AIFJ1607株是1種多重耐藥菌株。值得注意的是，硝基咪唑類耐藥基因NimC/NimA是首次發(fā)現(xiàn)在巴氏桿菌科細(xì)菌的基因組中的，以前的研究表明NimC/NimA基因被發(fā)現(xiàn)存在于沙門氏菌[21]、大腸桿菌[22]和抗輻射菌[23]中。砷抑制劑基因arsR是一種砷耐藥的調(diào)節(jié)基因[24]，也被發(fā)現(xiàn)在吲哚放線桿菌AIFJ1607株中。

插入序列(IS)是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座元件，由兩端的反向重復(fù)序列和中間的轉(zhuǎn)座酶編碼序列組成。插入序列廣泛存在于細(xì)菌的基因組和質(zhì)粒中并存在不同數(shù)量的拷貝，以相同或不同的轉(zhuǎn)座機(jī)制在基因組內(nèi)或基因組之間進(jìn)行水平移動(dòng)，也可作為其他移動(dòng)因子如噬菌體和質(zhì)粒的一部分進(jìn)行轉(zhuǎn)移。而在吲哚放線桿菌AIFJ1607株的耐藥基因島內(nèi)就存在多種插入序列，包括IS6、IS10、IS30、ISApl1和ISAbal4。據(jù)報(bào)道，插入序列ISApl1也被發(fā)現(xiàn)存在于胸膜肺炎放線桿菌[25-26]和大腸桿菌[27-29]的基因組中。出乎意料地是吲哚放線桿菌AIFJ1607株的耐藥基因島中存在3種插入序列ISApl1，分別為S1、S2和S3。其中插入序列S1中第486位的胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，但所對(duì)應(yīng)的氨基酸未發(fā)生改變。插入序列S2中有20個(gè)核苷酸發(fā)生了變異，所對(duì)應(yīng)的氨基酸分別由第7位的甘氨酸變?yōu)榻z氨酸、第65位的天冬酰胺變?yōu)榻M氨酸、第89位的賴氨酸變?yōu)楣劝滨０?、?1位的谷氨酸變?yōu)樘於０?、?79位的異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸。插入序列S3缺失了98個(gè)核苷酸。插入序列ISApl1包含2個(gè)閱讀框，分別為ORF1和ORF2，ORF1由307個(gè)氨基酸殘基組成，這與插入序列IS30相似，同時(shí)含有保守的DDE區(qū)域[30]。ORF2是一種假定的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，可以抑制轉(zhuǎn)座酶mRNA的翻譯[30]。當(dāng)然，吲哚放線桿菌AIFJ1607株的耐藥基因島不僅包含有多種插入序列，也同時(shí)含有移動(dòng)元件mobA。

來自吲哚放線桿菌AIFJ1607株的質(zhì)粒pAIFJ1含有3個(gè)編碼蛋白基因，分別為floR、lysR和repB基因。與來自副豬嗜血桿菌的質(zhì)粒pHPSGC(登錄號(hào)：KX966395)和質(zhì)粒pHPSF1(登錄號(hào)：KR262062)進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pAIFJ1和質(zhì)粒pHPSGC具有很高的同源性。另外，吲哚放線桿菌和副豬嗜血桿菌同屬巴氏桿菌科的成員，生長(zhǎng)都需要NAD的參與[5]。因此，這表明質(zhì)粒pAIFJ1有可能在副豬嗜血桿菌和吲哚放線桿菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，有待進(jìn)一步研究。