張小榮，王延龍，郭夢嬌，張成成，薄宗義，曹永忠，吳艷濤,*

(1.揚州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病預(yù)防控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009； 2.揚州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)根據(jù)群抗原特異性差異可以分為3個群[1]。Ⅰ群禽腺病毒最為常見，臨床上主要引起包涵體肝炎和心包積液綜合征，分為12個血清型，代表株為雞胚致死性孤兒病毒(CELOV)；Ⅱ群禽腺病毒包括火雞出血性腸炎病毒、雉雞大理石脾病病毒及雞大脾病病毒；Ⅲ群禽腺病毒包括減蛋綜合征病毒及來自鴨的相似病毒。

腺病毒載體是目前研究和應(yīng)用最廣的載體系統(tǒng)之一，其中以人源腺病毒載體的研究最為廣泛，已經(jīng)有相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用。近年來，隨著對禽腺病毒研究的逐漸深入，以禽腺病毒為載體開發(fā)禽用基因工程疫苗的研究也相繼被報道，常用作載體研究的病毒包括Ⅰ群禽腺病毒中的血清1、4和9型(FAdV-1、FAdV-4、FAdV-9)，展示出良好的應(yīng)用前景[2-5]。

近年來，腺病毒的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)已經(jīng)比較成熟，該技術(shù)通過將腺病毒全長基因組DNA克隆入質(zhì)粒載體獲得感染性克隆，可根據(jù)需要在DNA水平對病毒基因組進(jìn)行遺傳操作，然后將感染性克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞即可直接獲得重組病毒[4,6]。

本研究的目的是以實驗室前期分離和鑒定的1株天然無致病性的FAdV-1(JS2017株)為研究對象，將其完整基因組DNA克隆到黏粒載體內(nèi)，構(gòu)建感染性克隆，成功建立FAdV-1反向遺傳操作技術(shù)平臺，為進(jìn)一步將FAdV-1作為活病毒載體研發(fā)禽用基因工程疫苗提供平臺。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞株血清1型禽腺病毒(FAdV-1)JS2017株由本實驗室分離、鑒定和保存[7-8]；雞肝癌細(xì)胞LMH購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，編號為CRL-2117。

1.2 質(zhì)粒與菌株pCR2.1載體購自Invitrogen公司；黏粒載體SuperCos-1及其配套試劑購自Agilent公司；pEASYTM-T3克隆載體及Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物科技有限公司；大腸桿菌DH10B由本實驗室保存。

1.3 主要試劑dNTPs、EasyTaq DNA polymerase(5 U/μL)、T4DNA連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher Scientific公司；限制性內(nèi)切酶均購自New England Biolabs(NEB)公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒與DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；其他普通生化試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 FAdV-1 JS2017株病毒基因組DNA提取將FAdV-1 JS2017株病毒按MOI=0.1接種單層LMH細(xì)胞，培養(yǎng)4～5 d，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，同時收取細(xì)胞與培養(yǎng)上清，反復(fù)凍融3次后10 000×g離心10 min 后取上清經(jīng)超濾管10倍濃縮。濃縮液中加入等體積裂解液(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA、1% SDS、100 mg/L蛋白酶K)，37℃反應(yīng)13 h后經(jīng)酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀回收DNA，TE溶液(pH 8.0)溶解沉淀，測定濃度后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 UP、DOWN同源臂的擴增與克隆根據(jù)JS2017株的全基因組序列(GenBank登錄號：MK050972)，選取FAdV-1基因組左端1 186 bp(1～1 186 nt)、右端1 130 bp(42 610～43 739 nt)作為UP、DOWN同源臂，設(shè)計2對擴增引物FA-UF/R、FA-DF/R，分別用于UP、DOWN同源臂的擴增。在UP同源臂的上游引物5′端引入BamHⅠ和AscⅠ酶切位點，下游引物5′端引入SbfⅠ和NotⅠ酶切位點。在DOWN同源臂上游引物5′端引入SbfⅠ酶切位點，下游引物5′端引入 ApaⅠ、BamHⅠ和AscⅠ酶切位點。引物序列見表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以病毒全基因組DNA為模板，PCR擴增同源臂?；厥铡⒓兓幢蹟U增產(chǎn)物，并克隆進(jìn)pEASYTM-T3克隆載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化入Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，按說明書方法通過PCR篩選陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行測序驗證，重組克隆分別命名為pT-U和pT-D。

1.6 質(zhì)粒pCos-UD的構(gòu)建

1.6.1轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCR-UD的構(gòu)建 利用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切質(zhì)粒pT-U和pCR2.1，回收UP同源臂和線性化載體pCR2.1，經(jīng)T4DNA連接酶連接，獲得質(zhì)粒pCR-U。隨后用ApaⅠ和SbfⅠ雙酶切質(zhì)粒pT-D和pCR-U，回收DOWN同源臂和pCR-U載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建質(zhì)粒pCR-UD，并利用BamHⅠ酶切進(jìn)行鑒定。

1.6.2質(zhì)粒pCos-UD的構(gòu)建 黏粒載體SuperCos-1中含有新霉素抗性基因，與設(shè)計方案后續(xù)步驟中抗性基因的使用相沖突，因此首先利用Hind Ⅲ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶對SuperCos-1進(jìn)行雙酶切去除新霉素抗性基因，通過Klenow大片段對DNA末端補平后重新進(jìn)行連接獲得改造后質(zhì)粒SuperCosΔner。BamHⅠ分別酶切質(zhì)粒SuperCos-Δner、pCR-UD，回收后，經(jīng)T4DNA連接酶連接同源臂UD與線性化質(zhì)粒SuperCosΔner，構(gòu)建質(zhì)粒pCos-UD。

1.7 感染性克隆pCos-FAdV1的構(gòu)建首先，利用SbfⅠ酶切線性化質(zhì)粒pCos-UD，回收酶切產(chǎn)物。取線性化pCos-UD與1.4中提取的病毒全基因組DNA共同電轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，利用宿主菌BJ5183所攜帶的重組酶催化病毒基因組DNA末端與線性化pCos-UD中攜帶的UP和DOWN同源臂發(fā)生同源重組，從而將完整病毒基因組DNA整合入載體中。電轉(zhuǎn)化條件為電壓2 500 V、電阻200 Ω、電容25 μF，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌于37℃培養(yǎng)復(fù)蘇1 h后，均勻地涂布在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，使用禽Ⅰ群腺病毒通用引物Hex-F/R(表1)進(jìn)行重組克隆篩選[1]。將篩選出的陽性感染性克隆命名為pCos-FAdV1。感染性克隆構(gòu)建流程如圖1所示。由于大腸桿菌BJ5183內(nèi)部含有重組酶，有可能會引起感染性克隆中FAdV1基因組中重復(fù)序列的重組，造成基因重排，為防止這種現(xiàn)象發(fā)生，將在BJ5183內(nèi)重組獲得的感染性克隆pCos-FAdV1重新電轉(zhuǎn)化入缺少重組酶基因的大腸桿菌DH10B中。

圖1 感染性克隆構(gòu)建流程圖

1.8 感染性克隆pCos-FAdV1的鑒定采用2種方法分別對感染性克隆pCos-FAdV1進(jìn)行鑒定。首先針對感染性克隆不同位置共設(shè)計5對引物：F-fiber1/2、F-orf10、F-orf11、FCS1、FCS2(表1)，通過PCR進(jìn)行鑒定。然后取PCR鑒定正確的單克隆進(jìn)行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ對感染性克隆進(jìn)行酶切圖譜分析。

表1 感染性克隆pCos-FAdV1構(gòu)建及鑒定引物

1.9 病毒拯救及復(fù)制能力的測定

1.9.1病毒cFAdV-1的獲取 利用在同源臂末端引入的限制性內(nèi)切酶AscⅠ酶切感染性克隆pCos-FAdV1，釋放完整的FAdV1基因組DNA片段，通過酚∶氯仿抽提和乙醇沉淀法回收酶切產(chǎn)物。按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)染進(jìn)LMH細(xì)胞，37℃培養(yǎng)3～4 d后，收取細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融后取100 μL，進(jìn)行盲傳，直至出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，收取細(xì)胞與上清，反復(fù)凍融后，繼續(xù)接種LMH細(xì)胞進(jìn)行擴大培養(yǎng)。將拯救出的病毒命名為cFAdV-1。

1.9.2生長曲線的測定 取病毒cFAdV-1，以及母本病毒JS2017株，使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋后按照MOI=0.1接種到狀態(tài)良好的LMH單層細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱吸附2 h后，更換為含有2% FBS的DMEM維持液。取接種后0，12，24，36，48，60，72 h的細(xì)胞與上清，反復(fù)凍融后進(jìn)行TCID50的測定，根據(jù)測定結(jié)果繪制病毒生長曲線，每個時間點設(shè)置3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 FAdV-1 JS2017株病毒全基因組的提取提取的病毒基因組經(jīng)分光光度法進(jìn)行測定，質(zhì)量濃度為700 mg/L，D260/D280=1.90。

2.2 UP、DOWN同源臂的擴增以提取的病毒全基因組為模板，采用同源臂擴增引物FA-UF/R、FA-DF/R對基因組1～1 186,42 610～43 739 nt 2個片段進(jìn)行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，大小分別為1 186，1 130 bp，與預(yù)期大小一致(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.UP同源臂擴增產(chǎn)物;2.DOWN同源臂擴增產(chǎn)物

2.3 質(zhì)粒pCos-UD的構(gòu)建

2.3.1中間質(zhì)粒pCR-UD的構(gòu)建與鑒定 將UP、DOWN同源臂克隆進(jìn)質(zhì)粒pCR2.1，構(gòu)建中間質(zhì)粒pCR-UD，經(jīng)BamHⅠ酶切后電泳可見4 000,2 316 bp 大小的條帶，與預(yù)期一致(圖3)。

M.DL5000 DNA Marker;1.質(zhì)粒pCR-UD酶切產(chǎn)物

2.3.2質(zhì)粒SuperCos-Δner的構(gòu)建與鑒定 刪除質(zhì)粒SuperCos-1的新霉素抗性基因，獲得質(zhì)粒SuperCos-Δner。經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后電泳可見條帶大小分別5 481,1 140 bp，而原始質(zhì)粒Supercos-1酶切后產(chǎn)生的條帶大小分別為6 800,1 140 bp，鑒定結(jié)果如圖4 所示，說明新霉素抗性基因已被成功刪除。

M.DL10000 DNA Marker;1.SuperCos-1酶切產(chǎn)物;2.SuperCos-Δner酶切產(chǎn)物

2.3.3質(zhì)粒pCos-UD的鑒定 將同源臂UP和DOWN整體克隆進(jìn)SuperCos-Δner獲得質(zhì)粒pCos-UD。利用限制酶EcoRⅤ和XbaⅠ對質(zhì)粒pCos-UD進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示目的條帶大小為5 068,3 869 bp，與預(yù)期一致(圖5)。

M.DL10000 DNA Marker;1.pCos-UD酶切產(chǎn)物

2.4 感染性克隆pCos-FAdV1的篩選和鑒定將線性化質(zhì)粒pCos-UD與FAdV-1病毒全基因組DNA共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183內(nèi)，通過同源重組的方法獲得包含完整病毒基因組的感染性克隆，經(jīng)FAdV1通用檢測引物Hex-F/R 擴增產(chǎn)物大小約為800 bp(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陽性感染性克隆;2.陰性對照;3.FAdV-1 DNA

將經(jīng)通用引物PCR篩選到的感染性克隆轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B內(nèi)，分別以5對引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖7所示，引物F-fiber1/2、F-orf10、F-orf11、FCS1和FCS2擴增產(chǎn)物大小分別為801，911，468，1 085,898 bp，鑒定結(jié)果均與預(yù)期一致。以Hind Ⅲ對感染性克隆進(jìn)行酶切圖譜分析，電泳結(jié)果見圖8，感染性克隆酶切后產(chǎn)生的條帶大小為12 250，9 193，6 845，5 446，4 748，4 108，4 046,3 736 bp，與預(yù)期一致。

M.DL2000 DNA Marker;1.引物F-fiber1/2;2.引物F-orf10;3.引物F-orf11;4.引物FCS2;5.FCS1;6.陰性對照

M.DL15000 DNA Marker;1.感染性克隆 pCos-FAdV1酶切產(chǎn)物

2.5 病毒拯救結(jié)果將AscⅠ酶切從感染性克隆pCos-FAdV1中釋放出的FAdV1基因組DNA轉(zhuǎn)染入LMH細(xì)胞并進(jìn)行盲傳，在盲傳第2代時觀察到FAdV感染細(xì)胞產(chǎn)生的典型細(xì)胞病變(圖9)，細(xì)胞間距增加、變圓、折光性增強。經(jīng)生長曲線測定，拯救出的病毒cFAdV-1與親本病毒JS2017株生長趨勢基本一致，說明具有相似的復(fù)制能力(圖10)。

A．接種cFAdV-1的LMH細(xì)胞；B.接種FAdV-1(JS2017)的LMH細(xì)胞；C.未接種病毒的LMH細(xì)胞

圖10 病毒cFAdV-1與FAdV-1(JS2017)生長曲線測定結(jié)果

3 討論

腺病毒載體是最具應(yīng)用前景的病毒載體之一，研究最廣泛的是人腺病毒載體，已有部分產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用，其中血清型5型人腺病毒被用于新冠肺炎疫苗的研發(fā)[9]。禽腺病毒載體在基因工程疫苗研發(fā)方面同樣展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但是國內(nèi)對于禽腺病毒載體的研究起步較晚。

重組腺病毒常用的構(gòu)建方法是在真核細(xì)胞中將2個重疊的病毒DNA片段之間發(fā)生同源重組，從中篩選出含有重組病毒的空斑。此方法同源重組效率低，并且需要對重組病毒進(jìn)行多輪費時、費力的純化過程。而CHARTIER等[10]基于相同的原理，在大腸桿菌中完成重組病毒的構(gòu)建，細(xì)菌內(nèi)同源重組法不僅克服了真核細(xì)胞內(nèi)同源重組效率低的缺點，且可以直接利用抗性篩選含有重組腺病毒載體的大腸桿菌，后期無需進(jìn)行繁瑣的病毒純化過程。禽腺病毒感染性克隆常在含有RecA重組酶的大腸桿菌BJ5183內(nèi)構(gòu)建，可以直接用于重組病毒的構(gòu)建，后期只需線性化重組感染性克隆并轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，便可以獲得純的重組病毒，無需病毒純化過程。FRANCOIS等[11-12]首次在黏粒載體中構(gòu)建含禽腺病毒全基因組的感染性克隆，通過基因突變對病毒復(fù)制非必需區(qū)進(jìn)行了驗證，構(gòu)建了表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的重組禽腺病毒。最近該方法又被成功用于FAdV-4感染性克隆的構(gòu)建[4]。

本研究同樣基于同源重組的原理，首先將FAdV-1 JS2017株基因組左右末端的序列順序插入黏粒載體SuperCos-1中，再與從病毒中提取的完整基因組DNA共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，利用BJ5183宿主菌體內(nèi)帶有的重組酶催化病毒末端同源區(qū)之間的重組，從而將JS2017株病毒基因組完整插入質(zhì)粒載體中。為鑒定克隆到載體中的病毒基因組完整性，首先針對病毒基因組與載體的連接區(qū)和病毒基因組不同部位設(shè)計了5對引物進(jìn)行PCR初步驗證，然后選擇合適的酶切位點進(jìn)行切割，分析其酶切圖譜，最后轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，結(jié)果均證明JS2017株基因組已經(jīng)按照預(yù)期設(shè)計完整插入質(zhì)粒載體中，感染性克隆構(gòu)建取得了成功，且拯救出的病毒與親本毒株在生物學(xué)特性方面無明顯差異。

綜上所述，本研究構(gòu)建的FAdV-1感染性克隆，可為今后以FAdV-1為載體開展基因工程疫苗的研究提供平臺，同時也可以用于探索FAdV-1基因組中未知功能的ORF在病毒復(fù)制及其與宿主相互作用中的地位。