伍輝吉，趙 丹，陳濟(jì)鐺，張溢珊，朱婉君，張濟(jì)培*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山528231；2.佛山萬(wàn)牧洲生物科技有限公司，廣東 佛山 528231)

星狀病毒(astroviruses,AstV)為無(wú)囊膜，單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約為6.8～7.9 kb[1]。5′非編碼區(qū)(5′UTR)開(kāi)始緊接著3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2)、3′非編碼區(qū)(3′UTR)以及多聚腺苷酸尾巴(poly-A tail)，其中ORF1a與ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白(capsid protein,CP)[2]。國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)(ICTV)根據(jù)感染宿主的不同將星狀病毒科劃分為2個(gè)不同的病毒屬：哺乳動(dòng)物星狀病毒屬(Mamastrovirus,MAstV)和禽星狀病毒屬(Avastrovirus,AAstV)，并規(guī)定ORF2全長(zhǎng)氨基酸序列的平均氨基酸遺傳距離為0.576～0.741,可劃分為不同種的星狀病毒[3]。ORF2編碼的衣殼蛋白，包括保守的N端和高變的C端，N端主要為衣殼殼體蛋白結(jié)構(gòu)域，C端主要為纖突蛋白(Spike)結(jié)構(gòu)域，是病毒主要的免疫原性蛋白[4]。YORK等[5-7]的研究均顯示通過(guò)重組系統(tǒng)表達(dá)的衣殼蛋白C端具有良好的免疫原性及反應(yīng)性。

2015年以來(lái)，中國(guó)山東、河南、河北、湖南、廣東、福建、黑龍江等地雛鵝群中相繼暴發(fā)致死性雛鵝內(nèi)臟痛風(fēng)。YUAN等[8-10]均于出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀的雛鵝體內(nèi)分離獲得2型鵝星狀病毒(GoAstV-2)，并通過(guò)病例復(fù)制試驗(yàn)證實(shí)2型鵝星狀病毒與雛鵝致死性內(nèi)臟痛風(fēng)相關(guān)。目前針對(duì)雛鵝致死性內(nèi)臟痛風(fēng)大多處于對(duì)癥治療階段，尚無(wú)有效商品化疫苗用于雛鵝致死性內(nèi)臟痛風(fēng)的防控，嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的1株鵝星狀病毒的ORF2即衣殼蛋白基因進(jìn)行序列測(cè)定，通過(guò)同源比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建、氨基酸平均遺傳距離計(jì)算了解分離株分子進(jìn)化情況。通過(guò)推導(dǎo)的氨基酸序列，預(yù)測(cè)衣殼蛋白纖突結(jié)構(gòu)(Spike)并通過(guò)生物信息學(xué)分析了解Spike蛋白的變異情況、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。運(yùn)用pET-30a表達(dá)載體及BL21(DE3)表達(dá)菌株完成Spike重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及初步表達(dá)，免疫新西蘭白兔獲得Spike蛋白多克隆抗體，以期為鵝星狀病毒Spike蛋白功能研究、血清學(xué)檢測(cè)方法的建立以及亞單位疫苗的制備奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與衣殼蛋白來(lái)源毒株由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病研究所2018年11月從廣東省肇慶市發(fā)生雛鵝痛風(fēng)的鵝廠中采集的組織樣品中分離獲得，命名為AstV/goose/Guangdong/1811LHC/2018，簡(jiǎn)稱LHC株。鵝星狀病毒衣殼蛋白由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病研究所以LHC株為模板構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)并純化獲得。

1.2 主要試劑TransZol Up Plus RNA Kit，BL21(DE3) Chemically Competent Cell(北京全式金生物技術(shù)公司)；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa LA Taq，E.coliDH5α Competent Cells，PMD18-T Vector(寶日生物技術(shù)(北京)公司)；Gel Extraction Kit(200)(OMEGA公司)；pET-30a(+)(優(yōu)寶生物科技公司)；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ，XhoⅠ，T4連接酶(New England Biolabs 公司)；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，IPTG(碧云天生物技術(shù)公司)；His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(康為世紀(jì)公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢三鷹生物技術(shù)公司)；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma 公司)。

1.3 衣殼蛋白基因序列測(cè)定與分析根據(jù)GenBank中保存的鵝源星狀病毒全基因序列(AXI69840)針對(duì)編碼衣殼蛋白的ORF2設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物JD256：5′-AGTCGGGCCCGACTTCT-3′；JD257：5′-CTGTACCCTCGATCCTACTCG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為2 215 bp。運(yùn)用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取病毒總RNA，PrimeScr-ipt Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。運(yùn)用引物JD256/JD257以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，Gel Extraction Kit(200)試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化。回收后的產(chǎn)物與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含氨芐的LB平板上。篩選出的陽(yáng)性克隆菌株送至生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI。

應(yīng)用EditSeq對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行ORF定位，并推導(dǎo)獲得LHC株衣殼蛋白氨基酸序列。應(yīng)用Conserved Domain Search進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，MegAlign對(duì)LHC株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的星狀病毒衣殼蛋白氨基酸序列做相似性分析，MEGA 7.0對(duì)其進(jìn)行遺傳距離分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 纖突蛋白理化特性分析根據(jù)Conserved Domain Search保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果推導(dǎo)獲得纖突蛋白編碼序列，并通過(guò)ExPAsy服務(wù)器的Protaram程序分析纖突蛋白理化性質(zhì)，I-TASSER進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，ESpript對(duì)LHC株纖突蛋白與其他鵝星狀病毒進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸序列多重比對(duì)。

1.5 纖突蛋白的原核表達(dá)及純化根據(jù)LHC株測(cè)序結(jié)果針對(duì)Spike基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。HJ-F1： 5′-TCTCATATGCAGGTTACACCCTCG-CTT-3′;HJ-R1：5′-TTGCTCGAGGTCAGTCTCA-TCTTCCGCTGT-3′,引入雙酶切位點(diǎn)NdeⅠ和XhoⅠ，預(yù)期目的片段大小為711 bp。運(yùn)用引物HJ-F1/HJ-R1以1.3所獲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物膠回收，獲得含有雙酶切位點(diǎn)的編碼纖突蛋白的cDNA片段，分別對(duì)回收的纖突蛋白cDNA片段與原核表達(dá)載體pET-30a(+)(Kan+)進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶雙酶切處理后回收，并將回收后載體與片段以1∶3混合后加入T4連接酶，16℃恒溫連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于卡那霉素抗性平板。通過(guò)雙酶切鑒定與測(cè)序驗(yàn)證獲得重組質(zhì)粒命名為pET-30a-Spike。

pET-30a-Spike重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21表達(dá)菌株，篩選陽(yáng)性菌株接種至Kan+(50 mg/L)LB肉湯，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜的菌液按1∶100接種至新鮮Kan+LB肉湯，振蕩培養(yǎng)(37℃，200 r/min)至D600值為0.6左右，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)37℃、100 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。含pET-30a(+)的對(duì)照菌株進(jìn)行同步誘導(dǎo)表達(dá)。重組纖突蛋白預(yù)期大小為26.8 kDa，C端含有His標(biāo)簽。培養(yǎng)好的菌液離心后用PBS重懸，超聲破碎后再離心，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的可溶性。

經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行初步鑒定后，按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白以1∶2 000比例稀釋的抗His的鼠單克隆抗體為一抗，1∶10 000比例稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。運(yùn)用截留相對(duì)分子質(zhì)量(MWCO)為10 kDa的蛋白超濾管對(duì)純化后的纖突蛋白溶液進(jìn)行離心濃縮后加入適量PBS再離心進(jìn)行纖突蛋白溶液的脫鹽和緩沖液更換，并運(yùn)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定纖突蛋白濃度，計(jì)算蛋白得率。

1.6 纖突蛋白多克隆抗體的制備及鑒定選擇8周齡，雌性，新西蘭兔作為免疫動(dòng)物。初次免疫：取0.4 mg 蛋白加PBS至總體積500 μL，與等量弗氏完全佐劑混勻并乳化后，皮下分點(diǎn)注射(4個(gè)部位，兩側(cè)腹股溝和腋窩)；初免14 d后二次免疫：取0.2 mg 蛋白加PBS至500 μL，與等量弗氏不完全佐劑混勻并乳化后，皮下注射；二免14 d 后第3次免疫：取0.1 mg蛋白加入100 μL PBS，不加佐劑，靜脈注射。于第2次加強(qiáng)免疫后7 d 耳緣靜脈采血，分離血清。 分別以原核表達(dá)的衣殼蛋白與纖突蛋白為抗原，1∶2 000比例稀釋的兔抗纖突蛋白血清為一抗，1∶10 000比例稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western blot 驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 衣殼蛋白序列測(cè)定及分子進(jìn)化分析衣殼蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)中于2 200 bp左右可見(jiàn)單一高亮條帶(圖1)，大小與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果經(jīng)ORF定位顯示LHC株衣殼蛋白基因全長(zhǎng)2 115 nt，共編碼704個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為77.6 kDa，其中第39～406位氨基酸殘基為預(yù)測(cè)的衣殼蛋白N端，構(gòu)成衣殼內(nèi)側(cè)的殼體蛋白，第425～665位氨基酸殘基為預(yù)測(cè)的衣殼蛋白C端，為殼體外側(cè)的纖突蛋白。

M.DL5000 DNA Marker；1.衣殼蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

衣殼蛋白氨基酸序列相似性分析顯示，分離株LHC與鵝星狀病毒2型(GoAstV-2)參考株相似性最高，達(dá)97.8%～99.2%，與火雞2型星狀病毒(TAstV-2)、鵝1型星狀病毒(GoAstV-1)、火雞1型星狀病毒(TAstV-1)、鴨1型星狀病毒(DAstV-1)、鴨2型星狀病毒(DAstV-2)、雞星狀病毒(CAstV)以及禽腎炎病毒(ANV)參考株之間的相似性均低于60%。氨基酸平均遺傳距離結(jié)果顯示，分離株LHC與GoAstV-2參考株的平均距離為0.011，而與GoAstV-1、TAstV-1、TAstV-2、DAstV-1、DAstV-2、CAstV以及ANV參考株間的平均遺傳距離均大于0.284，其中與TAstV-2間的平均遺傳距離最小，為0.566(表1)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，分離株LHC與GoAstV-2型參考株處于同一分支，與TAstV-2、DAstV-1距離較近，而與2014年從湖南腸炎型病鵝中分離到的鵝星狀病毒[11](FLX株)及其他禽星狀病毒距離較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 分離株LHC衣殼蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(▲表示分離株)

2.2 纖突蛋白理化特性分析Conserved Domain Search保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果提示衣殼蛋白第425～665位氨基酸殘基為纖突蛋白，共241個(gè)氨基酸殘基。ProtParam Tool理化特性分析結(jié)果顯示纖突蛋白等電點(diǎn)為4.47，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期為10 h，親水平均系數(shù)為-0.417。纖突蛋白氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示LHC株與2014—2018年于湖南、廣東、安徽、山東等地分離到GoAstV-2享有很高的序列以及結(jié)構(gòu)相似性，氨基酸序列相似性達(dá)96.3%～99.2%，僅出現(xiàn)個(gè)別氨基酸位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變。均具有3個(gè)α螺旋，11個(gè)β折疊，2個(gè)無(wú)規(guī)卷曲以及9個(gè)TT轉(zhuǎn)角(圖3)。

圖3 分離株纖突蛋白氨基酸序列與不同時(shí)間不同地區(qū)分離到的GoAstV-2參考株間的多重比對(duì)

2.3 纖突蛋白基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的鑒定運(yùn)用引物HJ-F1/HJ-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)于750 bp附近有1條高亮的單一熒光條帶，大小與預(yù)期相符(圖4)。

M.DL5000 DNA Marker； 1.纖突蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

pET-30a-Spike重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)分別于700，5 000 bp附近出現(xiàn)2條高亮條帶，大小均與預(yù)期相符。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證 pET-30-Spike構(gòu)建成功(圖5)。

M.DL15000 DNA Marker；1.pET-30a-Spike重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2.pET-30a空載質(zhì)粒雙酶切對(duì)照

2.4 纖突蛋白原核表達(dá)及鑒定如圖6所示，目的蛋白得到了正確表達(dá)，于25 kDa 附近出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預(yù)期大小相符，目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，少部分以包涵體形式存在沉淀中， BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)對(duì)照與轉(zhuǎn)化有pET-30a空載的BL21(DE3)的誘導(dǎo)對(duì)照均未出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的蛋白條帶。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Spike重組蛋白破碎后上清；2.Spike重組蛋白破碎后沉淀；3.BL21(DE3)菌株對(duì)照上清；4.BL21(DE3)菌株對(duì)照沉淀；5.含pET-30a空載的對(duì)照上清；6.含pET-30a空載的對(duì)照沉淀

Spike重組蛋白經(jīng)His標(biāo)簽鎳柱純化后，如圖7所示于25 kDa附近有單一的目的蛋白條帶表明已得到了高純度的Spike重組蛋白，純化后的蛋白紫外分光光度法測(cè)得質(zhì)量濃度為2.1 g/L。Spike重組蛋白Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色在25 kDa 附近出現(xiàn)單一清晰目的條帶，大小與預(yù)期相符。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4.Spike重組蛋白純化產(chǎn)物

2.5 纖突蛋白多克隆抗體的鑒定用兔抗纖突蛋白的血清作為一抗分別對(duì)纖突蛋白與衣殼蛋白進(jìn)行檢測(cè)，免疫前血清作為陰性對(duì)照，如圖8所示以兔抗纖突蛋白的血清作為一抗分別于25,78 kDa出現(xiàn)特異的纖突蛋白與衣殼蛋白條帶，免疫前血清作為一抗的陰性抗體對(duì)照未出現(xiàn)蛋白條帶，表明表達(dá)的纖突蛋白具有良好的免疫原性，兔抗纖突蛋白抗體能特異性識(shí)別2型鵝型狀病毒衣殼蛋白，制備的兔抗多克隆抗體具有良好的反應(yīng)活性。

M．預(yù)染的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.以1∶2 000的兔抗纖突蛋白的血清為一抗的被特異性識(shí)別的纖突蛋白(28.6 kDa)；2.以1∶2 000的兔抗纖突蛋白的血清為一抗的被特異性識(shí)別的衣殼蛋白蛋白(78 kDa)；3.以免疫前血清作為一抗未被特異性識(shí)別的纖突蛋白

3 討論

2014年，LIU等[11]在湖南一群表現(xiàn)為腸炎與零星死亡的寧鄉(xiāng)白鵝群中分離到第1株鵝星狀病毒2型毒株，命名為HN1G(KY807085)。2017年以來(lái)中國(guó)山東、湖南、廣東、河南、黑龍江等地雛鵝群相繼暴發(fā)致死性內(nèi)臟痛風(fēng)，姜曉寧等[12]于表現(xiàn)為痛風(fēng)的雛鵝中分離到鵝星狀病毒2型毒株，并通過(guò)病例復(fù)制試驗(yàn)證實(shí)致病病原為鵝2型星狀病毒。NIU等[13]從中國(guó)6省采集了4～21日齡病鵝樣品共計(jì)189份，檢出鵝源星狀病毒2型陽(yáng)性樣品154份，檢出率高達(dá)81.5%，提示鵝星狀病毒2型已在中國(guó)雛鵝群中形成廣泛傳播。本試驗(yàn)于2018年分離獲得的LHC株分子進(jìn)化分析顯示該分離株為鵝源星狀病毒2型毒株，與2014—2018年中國(guó)不同地區(qū)分離到的2型鵝源型狀病毒序列相似性達(dá)97.8%～99.2%，其中與2014年分離到HN1G株相似性為97.8%；表明2014—2018年中國(guó)不同地區(qū)間的鵝星狀病毒2型毒株尚未發(fā)生明顯變異，與正鏈RNA病毒進(jìn)化速率特征相符。

星狀病毒衣殼蛋白包括保守的N端和高變的C端，N端主要為衣殼殼體蛋白結(jié)構(gòu)域，C端主要為纖突蛋白結(jié)構(gòu)域。LEE等[14]運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得雞星狀病毒重組衣殼蛋白，免疫SPF雞可獲得中和抗體。通過(guò)推導(dǎo)的LHC株衣殼蛋白氨基酸序列分析其保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示第425～665位氨基酸殘基為衣殼蛋白纖突結(jié)構(gòu)，LHC株與鵝星狀病毒2型參考株纖突蛋白多重比對(duì)結(jié)果顯示，2014—2018年不同地區(qū)分離到的鵝星狀病毒2型毒株的纖突蛋白享有很高的序列以及結(jié)構(gòu)相似性，僅出現(xiàn)個(gè)別氨基酸位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，表明2014—2018年中國(guó)不同地區(qū)間的鵝星狀病毒2型毒株纖突蛋白尚未發(fā)生明顯變異。以LHC株為模板構(gòu)建鵝星狀病毒2型毒株纖突蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行初步表達(dá)，重組纖突蛋白可溶性分析結(jié)果顯示目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，少部分以包涵體形式存在沉淀中，與纖突蛋白親水性預(yù)測(cè)結(jié)果基本相符。免疫新西蘭白兔分離血清獲得多克隆抗體，以倍比稀釋的兔抗纖突蛋白的血清作為一抗對(duì)星狀病毒纖突蛋白及衣殼蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示抗體稀釋度達(dá)1∶2 000時(shí)仍可見(jiàn)清晰的纖突蛋白與衣殼蛋白條帶，表明制備的兔抗纖突蛋白多克隆抗體具有良好的免疫原性及反應(yīng)活性。

本試驗(yàn)運(yùn)用分子生物學(xué)方法測(cè)定了分離株LHC的衣殼蛋白基因，同源性、系統(tǒng)發(fā)育分析及氨基酸平均遺傳距離計(jì)算結(jié)果均表明分離株為鵝星狀病毒2型毒株，2014—2018年中國(guó)不同地區(qū)間的鵝星狀病毒2型毒株尚未發(fā)生明顯變異。成功構(gòu)建鵝星狀病毒2型纖突蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)獲得具有生物活性的重組纖突蛋白，免疫新西蘭白兔獲得具有反應(yīng)活性的多克隆抗體，為鵝星狀病毒纖突蛋白功能研究、血清學(xué)檢測(cè)方法的建立以及亞單位疫苗的制備奠定理論基礎(chǔ)。