于永樂，王吉貴，蘇 俊，楊雙雙，劉 瑩，李沛然，李兆達，劉維全*

(1．青島農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，山東 青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)大學 生物學院 農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室，北京 100193)

犬細小病毒病是由犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的一種急性、高度接觸性病毒性的傳染病，臨床上以出血性腸炎和化膿性心肌炎為特征[1]。CPV最早于1978年從患出血性腸炎的犬中被分離得到，是從臨床病犬中分離的第2種細小病毒(canine parvovirus type 2，CPV-2)，目前普遍認為CPV-2是貓細小病毒(feline parvovirus，F(xiàn)PV)的遺傳變種[2-3]。新型CPV-2變異毒株CPV-2a和CPV-2b毒株已成為優(yōu)勢毒株，在我國廣泛流行。近年來，CPV-2c逐漸被分離得到，而且其感染宿主范圍不斷擴大，急需開展廣泛的流行病學調(diào)查[4-6]。

犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)依據(jù)其血凝結果和中和試驗等差異，可劃分為CAV-Ⅰ和 CAV-Ⅱ 2個常見亞型，其中CAV-Ⅰ感染常導致犬傳染性肝炎(ICH)的發(fā)生，臨床上以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、黃疸、壞死性肝炎、彌散性血管內(nèi)凝血和血管炎為主要表現(xiàn)，還會導致非化膿性腦炎和腎小球腎炎出現(xiàn)[7-9]；CAV-Ⅱ可引起傳染性喉氣管炎和腸炎，感染了CAV-Ⅱ的犬通常表現(xiàn)出持續(xù)的高燒、咳嗽，并伴隨有其他臨床表現(xiàn)，如扁桃體炎、喉氣管炎、肺炎、嘔吐和腹瀉，是引起犬病毒性腸炎的主要病原體之一[10-11]。

目前CPV、CAV-Ⅰ和 CAV-Ⅱ在臨床上混合感染嚴重，單靠常規(guī)的臨床和實驗室診斷技術難以快速、準確的作出鑒別診斷，急需要建立新的快速、簡便、特異的診斷技術，以提供臨床或實驗室使用。對于上述3種病毒的單項PCR檢測方法已分別被成功建立且應用，但二聯(lián)和三聯(lián)PCR檢測方法由于反應組分更加復雜，反應體系優(yōu)化難度增大，一直難以建立和良好應用。本研究通過特異性引物設計，優(yōu)化各種PCR擴增條件，建立一種針對犬源DNA病毒(細小病毒、腺病毒Ⅰ型和Ⅱ型)的多聯(lián)PCR診斷技術，為臨床實踐或實驗室鑒別診斷，提供可靠的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 標準毒株CPV-BJ、CAV-Ⅰ、CAV-Ⅱ、犬瘟熱病毒(CDV)及犬副流感病毒(CPIV)由本室分離保存。

1.2 臨床病料送檢的病料為來自北京某地養(yǎng)殖場發(fā)病犬肛拭子，共計20份。按照1∶9的比例加入滅菌PBS緩沖液充分振蕩溶解，5 000 r/min 離心5 min，取上清液置于-20℃冰箱備用。

1.3 試劑DL2000 DNA Marker 購自北京索萊寶生物科技有限公司；2×PrimeStar Max Premix購自寶生物工程(大連)有限公司；GenElute膠回收試劑盒購自Sigma公司；質(zhì)粒小提中量提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.4 三聯(lián)PCR引物設計與合成根據(jù)GenBank已發(fā)表的CPV(CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ基因組序列，選擇CPV VP2和CAV E3區(qū)高同源序列，利用Primer Primier 5.0軟件，設計2對三聯(lián)PCR引物并由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，引物序列如下：

CPV為P1：GTAAGCTTCCAGGAGACTTT，P2：GTAAGCTTCGTCGTGTTCTT；

CAV為P3：CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC，P4：CTTCGTGTCCGCTTCATG。

上述引物擴增目的片段大小分別為670 bp(CPV)、497 bp(CAV-Ⅰ)和1 019 bp(CAV-Ⅱ)。

1.5 病毒DNA模板制備方法分別將2種病毒的病毒懸液或者臨床病料300 μL置于離心管中，沸水浴 10 min 后，迅速冰浴2 min，然后用微量離心機于室溫以 8 500 r/min 離心6 min，吸取上清液用于后續(xù)PCR反應。

1.6 PCR擴增方法的建立及優(yōu)化利用1.5的方法分別提取CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ病毒培養(yǎng)物的病毒總DNA，置于-20℃冰箱備用。所有PCR反應總體積為25 μL,其中2×primeStar Max Premix(TaKaRa)12.5 μL，不同引物終濃度(0.12,0.16,0.20,0.24 μmol/L)，病毒基因組模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR條件為98℃預變性1 min；98℃變性10 s，不同退火溫度(52,54,56,58,60℃)退火10 s，72℃延伸10 s，30個循環(huán)；72℃延伸1 min。取6 μL PCR擴增產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察照相。

1.7 CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ各單項PCR方法的建立按照1.6的方法分別建立CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的單項PCR擴增方法，確定其最適引物濃度和退火溫度，在此基礎上，對各單項PCR的特異性和敏感性進行檢測，并對所有擴增產(chǎn)物進行膠回收，目的片段送公司測序驗證。

1.8 CPV、CAV-Ⅰ和CPV、CAV-Ⅱ二聯(lián)PCR方法的建立按照1.7的方法分別建立上述對于CPV和CAV-Ⅰ二聯(lián)PCR與CPV和CAV- Ⅱ二聯(lián)PCR方法，并對二聯(lián)PCR方法的重復性和特異性進行檢測，并對所有擴增產(chǎn)物進行膠回收，目的片段送公司測序驗證。

1.9 三聯(lián)PCR擴增試驗在三聯(lián)PCR反應體系中，各病毒引物終濃度分別為CPV 0.20 μmol/L,CAV-Ⅰ 和CAV- Ⅱ 各0.20 μmol/L。三聯(lián)PCR反應條件與二聯(lián)PCR保持一致，分別對上述病毒的DNA模板進行檢測。

1.10 三聯(lián)PCR重復性試驗按照1.8的方法，進行三聯(lián)PCR重復性檢測。

1.11 三聯(lián)PCR特異性試驗將3種不同的三聯(lián)PCR產(chǎn)物分別回收后，送公司測序并分析；對CDV北京株、CPIV北京株及MDCK細胞等進行PCR擴增。

1.12 三聯(lián)PCR敏感性試驗將CPV、CAV-Ⅰ與CAV- Ⅱ的原倍10-1，10-2，10-3，10-4,10-5倍稀釋度的DNA模板組合，進行三聯(lián)PCR靈敏度檢測。

1.13 三聯(lián)PCR對送檢病料的檢測利用已建立的三聯(lián)PCR對送檢的20份病料進行檢測，并與單項PCR檢測結果進行比較分析。

2 結果

2.1 CPV、CAV-Ⅰ和CAV- Ⅱ單項PCR的建立結果由圖1可見，以1.6的方法分別以CPV、CAV-Ⅰ和CAV- Ⅱ進行單項PCR擴增試驗，結果擴增片段與目的片段的大小完全一致。經(jīng)測序證實，所有擴增的片段與CPV、CAV-Ⅰ和CAV- Ⅱ相應基因序列高度一致，同源性高達99%。

A.CPV(M.DL2000 DNA Marker)；B.CAV-Ⅰ(M.DL5000 DNA Marker);C.CAV- Ⅱ(M.DL5000 DNA Marker)

2.2 CPV、CAV-Ⅰ和CPV、CAV-Ⅱ二聯(lián)PCR建立結果所建立的二聯(lián)PCR分別對CPV和CAV-Ⅰ、CPV和CAV-Ⅱ以及CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ進行擴增，重復性3次均能夠取得良好的擴增結果，而且CDV、CPIV結果為陰性，證明特異性良好(圖2)。

A.CPV和CAV-Ⅰ、CPV和CAV-Ⅱ以及CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ二模板PCR；B.二聯(lián)PCR重復性試驗結果；C.二聯(lián)PCR特異性試驗結果。M.DL2000 DNA Marker

2.3 三聯(lián)PCR擴增試驗結果由圖3可知，應用之前建立的最佳反應條件，三聯(lián)PCR一次性成功擴增出670 bp(CPV)、497 bp(CAV-Ⅰ) 和1 019 bp(CAV-Ⅱ)的3條目的片帶(圖3)，經(jīng)測序證實，所有擴增的片段與CPV、CAV-Ⅰ和CAV- Ⅱ相應基因序列高度一致。

1.CPV;2.CAV-Ⅰ;3.CAV-Ⅱ;4.CPV+CAV-Ⅰ+CAV-Ⅱ。M.DL2000 DNA Marker

2.4 三聯(lián)PCR重復性、特異性和靈敏度檢測結果由圖4可知，三聯(lián)PCR重復3次均可以獲得一致的擴增結果，而且與犬相關的2種病毒：CDV和CPIV檢測結果均為陰性，證明該方法具有很高的特異性；靈敏度試驗結果顯示，三聯(lián)PCR至少可檢出約0.16 pg DNA。

A.重復性試驗結果(1～3.CPV+CAV-Ⅰ+CAV-Ⅱ);B.特異性試驗結果(1～3.CPV+CAV-Ⅰ+CAV-Ⅱ、CDV、CPIV);C.靈敏度試驗結果(1～6.100,10-1,10-2,10-3,10-4 ,10-5)。M.DL2000 DNA Marker

2.5 CPV-CAV-Ⅰ -CAV-Ⅱ三聯(lián)PCR對病料的檢測結果在20份送檢樣品中，應用三聯(lián)PCR方法進行檢測，部分結果如圖5所示，其中CPV陽性者15份，CAV-Ⅰ陽性者5份，CAV-Ⅱ陽性者1份，其中CPV與CAV-Ⅰ混合感染4份，CAV-Ⅰ與CAV-Ⅱ混合感染1份。與單項PCR檢測結果完全一致(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.分別為臨床病料

3 討論

本試驗在進行 CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ單項 PCR 的基礎上，通過對病毒引物用量及反應溫度的篩選，建立了CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ二聯(lián)和三聯(lián)PCR的快速、特異的鑒別診斷方法。

該研究采用劉維全等[12]報道的CPV通用引物、王雷等[13]報道的CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ鑒別引物進行了單項PCR試驗的優(yōu)化，并對病料 DNA 模板的制備及PCR反應條件進行了改進，利用煮沸法提取病毒核酸，大大縮短了核酸提取時間；利用2×PrimeStar Max Premix進行擴增只需40 min即可完成PCR過程。劉大飛等[7]同樣建立了用于同時檢測犬瘟熱病毒、CPV、Ⅰ型和Ⅱ型CAV的多重PCR方法，與之相比，本研究所設計的CPV通用引物可以同時檢測CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c 4種亞型，而且最低檢測限度為0.16 pg，靈敏度更高，反應速度更快。

近年來，隨著寵物養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，犬細小病毒性腸炎和CAV感染對寵物業(yè)的危害日益加重。本研究建立的CPV、CAV-Ⅰ 和CAV-Ⅱ三聯(lián)PCR診斷方法，能夠快速準確地對CPV、CAV-Ⅰ 和CAV-Ⅱ的臨床感染樣品進行檢測，為病原體的快速診斷建立了一種簡單、經(jīng)濟、靈敏的方法。