董奇觀，楊玉超，朱瑞武，楊巖

(遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)撫礦總醫(yī)院，1.腫瘤放射治療科；2.神經(jīng)內(nèi)科；3.心胸外科；4.腫瘤放射治療科，遼寧 撫順 113008)

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，患者表現(xiàn)為上腹不適、噯氣，易被忽略，發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期[1]。了解胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及新型分子標(biāo)記物，有利于胃癌診斷和確定治療靶點(diǎn)。microRNAs(miRNAs)是一類高度保守、長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，可參與增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管形成、免疫應(yīng)答等眾多生物學(xué)過(guò)程[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、血管形成、免疫應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)控作用。同時(shí)，國(guó)外研究[4]表明，miR-320a在胃癌患者血清及組織中低表達(dá)。叉頭框蛋白Q1(fork head box Q1，F(xiàn)OXQ1)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移[5]。生物信息學(xué)分析顯示，miR-320a在FOXQl的3’端非翻譯區(qū)存在潛在結(jié)合位點(diǎn)[6]。本研究旨在探討miR-320a和轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白Q1(FOXQl)在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年1月遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)撫礦總醫(yī)院收治的40例胃癌患者為研究對(duì)象。其中男性22例，女性18例；年齡40～70歲，平均(53.71±6.43)歲；≥50歲23例，<50歲17例[7]；腫瘤直徑≥4 cm 15例，<4 cm 25例[8]；腫瘤位置：胃賁13例，胃體10例，胃竇15例，全胃3例；AJCC分期[9]：Ⅰ期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ期12例；腫瘤分化程度[10]：低分化10例，中分化14例，高分化16例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者18例；浸潤(rùn)程度：深肌層浸潤(rùn)13例，淺肌層浸潤(rùn)10例，無(wú)浸潤(rùn)者17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》中診斷，并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為腺癌[11]；(2)年齡40～70歲；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)器質(zhì)性疾病；(2)合并其他惡性腫瘤者；(3)胃癌切除前進(jìn)行免疫及化療等治療；(4)臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集腫瘤組織兩份，一份放入4%甲醛中固定用于免疫化學(xué)染色，一份用于提取RNA。另在腫瘤邊緣5 cm外采集癌旁組織，液氮冷凍，-80℃保存。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè) 取2 mm3樣本組織超聲勻漿，隨后加入1 mL TrizolTM Reagent試劑(上海創(chuàng)賽科技有限公司，貨號(hào):15596026)，室溫靜置10 min后加入340 μL氯仿，震蕩均勻，4 ℃、12 000 rpm離心10 min，吸取上層水相并加入等體積的異丙醇，震蕩均，室溫反應(yīng)10 min，4 ℃、12 000rpm離心10 min，棄上清液，室溫放置15 min 晾干，焦碳酸二乙酯水溶解，取l μL RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，采用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA純度及濃度，然后將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA：計(jì)算RNA需要量(反應(yīng)體系中所需RNA量為1 000 ng，體系為20 μL)，用200 μL EP 管，加入RNA的體積為V=1 000 ng/RNA 濃度，剩余體積用無(wú)RNA酶的水定容至10 μL；配制反應(yīng)試劑混合液；吸取10 μL反應(yīng)混合物加至每管(每管10 μL反應(yīng)試劑混合物+10 μLRNA液)，混勻后置于冰上，行逆轉(zhuǎn)錄；將cDNA產(chǎn)物稀釋10倍，-20 ℃保存待用。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min、30 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按Direce PCR Kit(上海鈺博科技有限公司，貨號(hào)：YB302A)說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。miR-320a上游引物序列：5’- GTT GGA TCC GGC GTT TCC TTC CGA CAT G-3’，下游引物序列：5’- GCT GAA TTC GTC CAC TGC GGC TGT TCC-3’，擴(kuò)增片段大小為22 bp；U6上游引物序列：5’-CGC TTCA CGA ATT TGC GTG TCA T-3’，下游引物序列:5’-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3’，擴(kuò)增片段大小為370 bp；FOXQ1上游引物序列：5’-CGC GGA CTT TGC ACT TTG AA-3’、下游引物序列：5’-AGC TTT AAG GCA CGT TTG ATG GAG-3’，擴(kuò)增片段大小為162 bp；β-actin上游引物序列：5 ’-TCC CTG TAT GCC TCT GG-3’，下游引物序列：5’-TGT CAC GCA CGA TTT CC-3’， 擴(kuò)增片段大小為134 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL[12]，加入以下試劑：cDNA1 μL、引物1 μL、TaqMan GEx MASTERMix 10 μL，加雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)10 min，92 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)l min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。得到的數(shù)據(jù)用ABI公司(Applied Biosystems)提供的軟件SDS2.4計(jì)算[13]。選擇β-actin作為FOXQ1的內(nèi)參，選擇U6作為miR-320a的內(nèi)參，所有反應(yīng)均在PCR儀中完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次，得到結(jié)果的Ct值(threshold cycle)定義為達(dá)到超出實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中檢測(cè)閾值時(shí)所需要的臨界循環(huán)數(shù)。△Ct表示研究標(biāo)本中miRNA相對(duì)內(nèi)參的表達(dá)量，ACt =CtmiRNA-CtU6，以2-△△Ct表示miRNA相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=(CtmiRNA癌組織-CtU6癌組織)-(CtmiRNA癌旁組織-CtU6癌旁組織)，計(jì)算出miR-320a相對(duì)表達(dá)量的平均值為0.54，以miR-320a相對(duì)表達(dá)量的平均值為界限，>0.54為miR-320a 高表達(dá)，≤0.54為miR-320a低表達(dá)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷 免疫組織化學(xué)染色按照En Vision(試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，貨號(hào):KIT-5020)兩步法進(jìn)行：使用4%甲醛固定標(biāo)本24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，切片浸于3%H2O2溶液中3 min，檸檬酸高壓抗原修復(fù)10 min，-抗4 ℃孵育過(guò)夜，通用型二抗-HRP聚合物，37 ℃孵育30 min，滴加DAB顯示，顯微鏡下觀察顯色情況，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸乙醇分化，PBS沖洗返藍(lán)，乙醇脫水、透明、中性樹(shù)膠封固。用陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。FOXQl結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用Greens-pan半定量法判斷陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞染色強(qiáng)度[14-15]；每例觀察5個(gè)以上高倍視野(400×)，計(jì)數(shù)不少于1 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。FOXQ1表達(dá)陽(yáng)性參考Liang等[16]的判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞率得分和染色強(qiáng)度得分相乘即為最后得分，0～3分定義為陰性，4～12分定義為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織miR-320a表達(dá)量比較

癌組織中miR-320a相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 癌組織和癌旁組織miR-320a及FOXQl mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 癌組織和癌旁組織FOXQl表達(dá)情況比較

FOXQl在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2及圖1。

表2 癌組織和癌旁組織間FOXQl表達(dá)[n(%)]

2.3 miR-320a及FOXQl表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-320a及FOXQl表達(dá)水平與腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度有關(guān)(P<0.05)；與年齡、性別、腫瘤位置無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-320a及FOXQl表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 影響胃癌患者預(yù)后的因素

對(duì)患者進(jìn)行3年隨訪，隨訪時(shí)間至2021年2月，均無(wú)失訪，以死亡為隨訪終點(diǎn)事件。40例患者死亡12例，3年生存率為70.00%。單因素結(jié)果顯示，腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度及miR-320a、FOXQl表達(dá)為影響患者預(yù)后的因素(P<0.05)；多因素分析顯示，腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度及miR-320a、FOXQl表達(dá)為影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 影響胃癌患者預(yù)后的因素

2.5 miR-320a及FOXQl表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

miR-320a低表達(dá)和FOXQl陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率低于miR-320a高表達(dá)和FOXQl陰性表達(dá)患者(60.71%vs.91.67%,χ2=3.832,P=0.039,56.00%vs.93.33%,χ2=6.222,P=0.013)。見(jiàn)圖2及圖3。

3 討論

2012年全球新發(fā)胃癌95.1萬(wàn)，我國(guó)約占50%，且死亡率約占45%[17]。因此，早診斷及治療對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要。miRNA是一類高度保守、長(zhǎng)約19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可能參與了增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管形成、免疫應(yīng)答等眾多生物學(xué)過(guò)程[18]。miR-320a已被證明是一種具有抑制腫瘤增殖和侵襲功能的miRNA[19-20]。在結(jié)腸癌中，miR-320a可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)及增殖[21]；miR-320a通過(guò)抑制Wnt/p-catenin通路抑制前列腺癌的干細(xì)胞特性[22]；在白血病細(xì)胞中miR-320a通過(guò)靶定CD71抑制增殖[23]；在非小細(xì)胞肺癌中，miR-320a可抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管形成和腫瘤細(xì)胞遷移[24]。此外，miR-320a 能重塑基質(zhì)纖維細(xì)胞，減慢腫瘤發(fā)展。另有報(bào)道[25]表明，miR-320a具有癌基因的作用。丁兢等[26]研究表明，miR-320a/c/d通過(guò)抑制抑癌基因的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。而本研究證實(shí)，癌組織中miR-320a相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(P<0.05)，與唐淑麗等[27]研究一致，說(shuō)明胃癌腫瘤形成過(guò)程中，miR-320具有抑癌基因功能，其表達(dá)降低促進(jìn)胃癌的形成。miR-320a表達(dá)與腫瘤直徑、AJCC分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度有關(guān)(P<0.05)，因此推測(cè)miR-320a表達(dá)降低參與了胃癌發(fā)生發(fā)展，與胃癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移中有關(guān)。此外， miR-320a低表達(dá)的患者3年生存率低于miR-320a高表達(dá)的患者(P<0.05)，提示隨著miR-320a表達(dá)的降低，胃癌病情進(jìn)展快，惡性程度越高，可進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后較差，進(jìn)一步說(shuō)明miR-320a可能是潛在的胃癌治療靶點(diǎn)。

FOXQ1是核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在發(fā)育、代謝、腫瘤及老化中具有重要作用，其通過(guò)TGF-B/Smad途徑作為NF-kB的核內(nèi)拮抗劑，阻止NF-kB乙?；?，減少NF-kB過(guò)度激活引起的腫瘤；并可減少Shh通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。同時(shí)，Wnt/3-catenin通路參與調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和粘附[28]。相關(guān)研究[29]表明，F(xiàn)OXQ1與胃上皮分化有關(guān)。同時(shí)楊欣怡等[30]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后明顯相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQl mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.05)，且FOXQl在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)，提示FOXQl與胃癌發(fā)生相關(guān)。FOXQl表達(dá)與腫瘤直徑、分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度有關(guān)，提示FOXQl高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移。此外，F(xiàn)OXQl陽(yáng)性患者3年生存率低于FOXQl陰性患者(P<0.05)，提示胃癌中FOXQl陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后較差，可能與其對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力調(diào)節(jié)有關(guān)，說(shuō)明miR-320a可能是潛在的胃癌治療靶點(diǎn)。但本研究納入例數(shù)較少，且對(duì)預(yù)后隨訪時(shí)間較短，下一步研究將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步論證。

綜上，miR-320a低表達(dá)和FOXQl陽(yáng)性與胃癌生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，可作為病情評(píng)估和預(yù)后的靶標(biāo)分子。