江 瑾 于春華 仇 妮 王 芳 張 明

人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPLFCs）是一種具有多向分化功能的群體細(xì)胞，是牙周組織增殖過程中起主導(dǎo)作用的細(xì)胞[1]。hPLFCs的凋亡是牙周組織破壞的重要病理生理過程，hPLFCs的凋亡已被認(rèn)為是牙周炎、根尖周炎的病理生理因素之一[2]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種重要的影響hPLFCs細(xì)胞功能的外界刺激因子。TNF-α對于hPLFCs生物學(xué)特性的影響受到越來越多學(xué)者廣泛關(guān)注[3，4]。研究表明，TNF-α可以誘導(dǎo)hPLFCs發(fā)生細(xì)胞凋亡[5]。尋找具有抑制hPLFCs細(xì)胞凋亡作用的藥物，是近年來藥物研究的熱點之一。

復(fù)方丹參滴丸（compound danshen dripping pills，CDDP）是利用現(xiàn)代制藥技術(shù)研制而成的一種純中藥滴丸劑，主要成分為丹參、三七和冰片，其主要成分是丹參水溶性成分和三七的水溶性成分。該藥起效快，副作用小，生物利用度高，具有活血化瘀、理氣止痛之功能，在臨床上廣泛用于冠心病、心絞痛的預(yù)防、治療、急救，在擴(kuò)張血管、清除自由基、改善微循環(huán)等方面具有一定的臨床價值[6～9]。目前，有關(guān)CDDP在牙周疾病中對于TNF-α誘導(dǎo)牙周組織凋亡作用的研究尚不多見。因此，本研究擬通過TNFα誘導(dǎo)hPLFCs細(xì)胞凋亡，探討CDDP對于hPLFCs細(xì)胞凋亡的影響及機制，為進(jìn)一步的深入研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

資料和方法

1.實驗試劑和儀器：復(fù)方丹參滴丸（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）；TNF-α、MTT（Sigma公司）；胎牛血清FBS（Gibco公司）；α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、PVDF蛋白轉(zhuǎn)印膜（碧云天生物技術(shù)研究所公司）；anti-p53抗體、anti-Bax抗體、anti-Bcl-2抗體和anti-β-actin抗體（Santa Cruz公司）；超凈工作臺（蘇州凈化有限公司）；酶標(biāo)儀與電泳裝置（美國Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

2.hPLFCs的體外培養(yǎng)：hPLFCs（武漢普諾賽生命科技有限公司），于5% CO2、37℃下培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基中，常規(guī)換液，待細(xì)胞長至80%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

3.MTT法檢測TNF-α對hPLFCs增殖的影響胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞以5×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24h后，加入不同濃度TNF-α（25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL溶于PBS），置于37℃恒溫箱中孵育4h。吸去上清后，每孔加入150μL二甲基亞砜隨后震蕩10min溶解藍(lán)色結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在490nm波長下測量其吸光度值。

4.CDDP溶液的制備：將CDDP置于研缽內(nèi)研碎，培養(yǎng)基溶解，超聲30min使藥完全溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.實驗分組處理：實驗分為3組：正常對照組：含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；TNF-α組：對照培養(yǎng)基加入200ng/mL TNF-α；TNF-α+CDDP組：對照培養(yǎng)基中加入200ng/mL TNF-α與270mg/mL、540mg/mL、1080mg/mL CDDP。

6.流式細(xì)胞儀檢測hPLFCs細(xì)胞凋亡：細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞經(jīng)不同實驗組預(yù)處理48h后，4℃預(yù)冷的PBS將各組細(xì)胞洗滌2次，加入含0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。隨后加入1mL的1倍Annexin V結(jié)合緩沖液，800r/min離心5min棄上清。加入結(jié)合緩沖液200μL重懸細(xì)胞。在細(xì)胞懸液中加入5mg/L的Annexin V-FITC 10μL及PI 5μL，混勻后37℃避光孵育30min。流式細(xì)胞儀以488nm為激發(fā)波長，530nm為發(fā)射波長檢測細(xì)胞凋亡率。

7.Western blot檢測hPLFCs凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞經(jīng)不同實驗組預(yù)處理24h后，PBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化并收集細(xì)胞。加入細(xì)胞蛋白裂解液RIPA，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取30μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離總蛋白后，濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行PVDF電轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1h，分別加入1:2000稀釋的鼠抗人p53、Bax、Bcl-2和β-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜。曝光分析結(jié)果，蛋白相對表達(dá)量以待測蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示。

8.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 21.0分析，統(tǒng)計學(xué)分析采用單因素方差分析進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同濃度TNF-α對hPLFCs增殖的影響：結(jié)果表明，hPLFCs細(xì)胞增殖與TNF-α濃度相關(guān)。與對照組相比，25ng/mL TNF-α作用的hPLFCs增殖變化不明顯；50ng/mL TNF-α細(xì)胞增殖略微下降；100ng/mL TNF-α細(xì)胞增殖顯著下降；200 ng/mL TNF-α細(xì)胞增殖下降程度更大（圖1）。因此，采用200ng/mL TNF-α進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度TNF-α對hPLFCs增殖的影響

2.CDDP對TNF-α誘導(dǎo)的hPLFCs增殖的影響結(jié)果表明，與對照組相比，TNF-α處理組的hPLFCs細(xì)胞增殖明顯降低。與TNF-α組相比，CDDP組細(xì)胞增殖顯著升高，且1080mg/mL CDDP組顯著高于540mg/mL CDDP組，1080mg/mL與540mg/mL CDDP組均顯著高于270mg/mL CDDP組（圖2）。

圖2 不同濃度CDDP對TNF-α誘導(dǎo)hPLFCs增殖的影響

3.流式細(xì)胞儀檢測CDDP對于TNF-α誘導(dǎo)的hPLFCs細(xì)胞凋亡的影響：結(jié)果顯示，對照組、TNF-α組、TNF-α+CDDP 270mg/mL組、TNF-α+CDDP 540mg/mL組、TNF-α+CDDP 1080mg/mL組的細(xì)胞凋亡率（Q2+Q4）分別是6.8%、35.9%、23.6%、16.6%、10.6%。與對照組比較，hPLFCs細(xì)胞經(jīng)TNF-α作用后，細(xì)胞凋亡率顯著增加。但是，CDDP組與TNF-α組相比細(xì)胞凋亡率顯著降低，且1080mg/mL CDDP組分別顯著低于540mg/mL CDDP組與270mg/mL CDDP組，540mg/mL CDDP組顯著低于270mg/mL CDDP組（圖3）。

圖3 不同濃度CDDP對TNF-α誘導(dǎo)人hPLFCs細(xì)胞凋亡的影響

4.蛋白免疫印跡法檢測CDDP對于TNF-α誘導(dǎo)的hPLFCs凋亡相關(guān)蛋白的影響：結(jié)果顯示，與對照組相比，p53、Bax在TNF-α組表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低。與TNF-α組比較，CDDP組p53、Bax蛋白表達(dá)逐漸下降。并且，1080mg/mL CDDP組分別顯著低于540mg/mL CDDP組與270mg/mL CDDP組，540mg/mL CDDP組 低 于270mg/mL CDDP組。除此之外，與TNF-α組比較，CDDP組Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸升高，1080mg/mL CDDP組分別顯著高于540mg/mL CDDP組與270mg/mL CDDP組（圖4）。

圖4 不同濃度CDDP對TNF-α誘導(dǎo)hPLFCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

hPLFCs細(xì)胞凋亡是一個由多種細(xì)胞因子、多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與的復(fù)雜的病理生理過程。針對hPLFCs細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究不僅有助于更深入地探討牙周病、根尖周病發(fā)病的分子機制，也為其防治研究提供了更多可能有效的干預(yù)環(huán)節(jié)。因此，本研究使用TNF-α誘導(dǎo)hPLFCs細(xì)胞凋亡，檢測CDDP對細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的影響，探索CDDP對hPLFCs細(xì)胞凋亡的抑制作用。

本實驗用流式細(xì)胞儀檢測hPLFCs的凋亡率，觀察到培養(yǎng)液中加入200ng/mL TNF-α作用正常細(xì)胞48h后，與對照組比較，hPLFCs的凋亡率明顯增高，這與文獻(xiàn)報道[10，11]是一致的。緊接著，采用流式細(xì)胞儀檢測CDDP對TNF-α誘導(dǎo)的hPLFCs細(xì)胞凋亡的影響。CDDP是第一個被美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入治療心血管疾病II期臨床試驗的中藥[12]。研究表明CDDP可以通過抑制糖尿病大鼠細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]。本研究的結(jié)果顯示，與TNF-α組比較，給予不同濃度的CDDP作用48h后，細(xì)胞凋亡率有所下降，且隨CDDP濃度的增大，hPLFCs的凋亡率下降的越明顯，說明CDDP可以有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的hPLFCs細(xì)胞的凋亡。

Bcl-2/Bax比值在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax具有直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2和Bax是正負(fù)調(diào)控的凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值決定著細(xì)胞區(qū)域凋亡還是存活[14]。p53是另一個介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到損傷、輻射等影響時，p53表達(dá)上調(diào)并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15，16]。本實驗中采用Western blot檢測TNF-α對于hPLFCs細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，TNF-α作用于hPLFCs后，hPLFCs出現(xiàn)大量凋亡，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，Bax、p53蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。但是，加入不同濃度CDDP作用后，細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)下降趨勢，Bcl-2表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性上升，Bax、p53表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量依賴性下降。由此可見，hPLFCs存在Bcl-2、Bax、p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，這些凋亡蛋白的高表達(dá)和失衡導(dǎo)致了細(xì)胞的大量凋亡，甚至導(dǎo)致牙周組織受損；而CDDP對TNF-α誘導(dǎo)的hPLFCs凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有一定的抑制作用，可以起到保護(hù)牙周組織的作用。