張艷寧 石 宏 趙增波 郝亞麗 李荷香

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，約占唾液腺惡性腫瘤的22%。此腫瘤無包膜，易于早期侵襲神經(jīng)，引起感覺異常、麻木和疼痛。發(fā)生在腮腺者可以引起患者面神經(jīng)麻痹或癱瘓，給患者帶來極大痛苦，也給臨床治療帶來困擾。以往研究表明，蛋白多糖廣泛存在于腺樣囊性癌腫瘤組織及腫瘤間質(zhì)中。抑制腺樣囊性癌細胞蛋白多糖合成與分泌，能夠明顯抑制其生長、增殖、轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲等惡性生物學(xué)行為過程[1，2]。本研究以人周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的雪旺細胞為對照，檢測硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs），包括GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、HSPG2、SDC1、SDC2、SDC3、SDC4，在腺樣囊性癌中的表達，并探討其在腺樣囊性癌侵襲周圍神經(jīng)過程中的作用。

資料和方法

一、細胞培養(yǎng)

人唾液腺腺樣囊性癌細胞株SACC-83細胞（來自北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科研究室）于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素）中，于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

人雪旺細胞（Cat.NO:1700，ScienCell，美國）在含5%血清的培養(yǎng)基（SCM，Cat.No：1701，ScienCell，美國），于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、HSPGs在腺樣囊性癌細胞中的表達

采用Real time PCR檢測HSPGs（GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、HSPG2、SDC1、SDC2、SDC3、SDC4）在SACC-83細胞與人雪旺細胞中的相對表達量。

TRIzol法（Invitrogen，美國）提取SACC-83細胞和人雪旺細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，MBI Fermentas，美國），反應(yīng)條件：60℃，5分鐘；42℃，60分鐘；70℃，5分鐘。

實時熒光定量（7500 Real time PCR System，Applied Biosystems，USA）：50℃，2分鐘；95℃，10分鐘；95℃變性20秒，57℃退火20秒，72℃延伸31秒，共40個循環(huán)。生成融解曲線（The Melt Curve）：95℃，15秒；60℃，1分鐘；95℃，30秒；60℃，15秒。

采用2-△△CT相對定量法計算樣本中基因相對表達量。

引物序列如下見表1。

表1 引物序列表

三、免疫組織化學(xué)檢測SDC1、SDC4在腺樣囊性癌伴神經(jīng)侵襲組織中的表達

臨床收集2007至2021年間，來自河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔頜面外科就診的唾液腺腺樣囊性癌伴神經(jīng)侵襲病例23例。腫瘤組織福爾馬林固定，同時由兩名病理醫(yī)師進行病理學(xué)診斷為“腺樣囊性癌”，組織學(xué)描述鏡下可見神經(jīng)侵襲。根據(jù)上述Real time PCR檢測結(jié)果，采用免疫組織化學(xué)法（PV6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國）檢測SDC1（1:100，Cat.NO:5608-1，Epitomics，美國）、SDC4（1:100，Cat.NO:AF0831-100，Affinity公司，美國）在腺樣囊性癌組織中的表達。根據(jù)細胞著色深度進行半定量分析：腫瘤細胞或腺腔內(nèi)黏液不著色為陰性（-），淺棕色者為弱陽性（+）、棕色為陽性（++）、深棕色者為強陽性（+++）。由兩名病理醫(yī)師共同對著色程度進行判斷，并分為低表達組（-、+）、高表達組（++、+++）。采用IBM SSPSS 21.0軟件、Fisher確切概率法進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HSPGs在唾液腺腺樣囊性癌細胞中的表達

Real time PCR檢測HSPGs mRNA（GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、HSPG2、SDC1、SDC2、SDC3、SDC4）在SACC-83細胞、人雪旺細胞中的相對表達量。結(jié)果顯示，SDC1在SACC-83細胞中的表達是人雪旺細胞的5.49倍，SDC4在SACC-83細胞中的表達是人雪旺細胞的2.09倍，均高于人雪旺細胞2倍以上（圖1）。

圖1 Real time PCR檢測HSPGs在SACC-83細胞和人雪旺細胞的表達（N＝3）

二、SDC1、SDC4在唾液腺腺樣囊性癌伴神經(jīng)侵襲組織中的表達

臨床收集唾液腺腺樣囊性癌伴神經(jīng)侵襲23例（圖2）?；颊吣挲g33~72歲，平均年齡52.6歲，男女比例為15：8。其中大唾液腺者18例，小唾液腺者5例。

圖2 唾液腺腺樣囊性癌伴周圍神經(jīng)侵襲（HE，×200）

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，SDC1在腺樣囊性癌腫瘤組織表達陽性（23/23，100%），主要表達于腫瘤細胞膜、細胞漿及腫瘤細胞外基質(zhì)內(nèi)，在神經(jīng)纖維束表達亦呈陽性。在神經(jīng)侵襲部位與遠離神經(jīng)侵襲部位（鏡下遠離受侵襲神經(jīng)束約2.5mm）表達無差別（圖3）。SDC4在腺樣囊性癌腫瘤組織均有表達（圖4），主要表達于腫瘤細胞膜和細胞漿，在神經(jīng)纖維表達陽性。同時免疫組化半定量分析結(jié)果顯示，SDC4在伴有神經(jīng)侵襲部位的腫瘤細胞中表達強陽性5例，陽性16例，弱陽性2例；而遠離神經(jīng)侵襲部位的腫瘤組織中表達陽性1例，弱陽性8例，陰性14例。差別顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（表2，P＜0.05）。

圖3 SDC1蛋白在腺樣囊性癌組織中表達陽性（IHC，×200）

表2 SDC4蛋白在腺樣囊性癌伴神經(jīng)侵襲腫瘤組織中的表達統(tǒng)計（N＝23）

圖4 SDC4蛋白在腺樣囊性癌組織中表達陽性（IHC）

討 論

唾液腺腺樣囊性癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移比較少見，卻極易侵襲周圍神經(jīng)組織，表現(xiàn)為包裹周圍神經(jīng)，破壞神經(jīng)束膜，侵襲神經(jīng)纖維束，或沿神經(jīng)纖維束生長，甚至還可以出現(xiàn)沿神經(jīng)束膜的跳越式轉(zhuǎn)移。因此周圍神經(jīng)侵襲生長也被認為是腺樣囊性癌遠處轉(zhuǎn)移的途徑之一。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，抑制腺樣囊性癌細胞蛋白多糖的合成分泌，能夠明顯降低其神經(jīng)侵襲能力[2]。

HSPGs廣泛分布于多種腫瘤組織，如結(jié)直腸癌、唾液腺腺樣囊性癌和多形性腺瘤等腫瘤細胞及細胞外基質(zhì)中[3，4]。在應(yīng)用免疫電鏡和原位雜交技術(shù)對五種不同的腺樣囊性癌細胞株的檢測中均發(fā)現(xiàn)：腺樣囊性癌細胞產(chǎn)生470kDa核心蛋白的HSPG，它與Ⅳ型膠原等細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）共同作用于腺樣囊性癌細胞的轉(zhuǎn)移過程[5]。而且，轉(zhuǎn)移能力不同的腺樣囊性癌細胞株有不同的蛋白多糖表達。衛(wèi)晉雄等[6]曾比較腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細胞株ACC-M與其母系細胞ACC-2中HSPGs表達分析，發(fā)現(xiàn)具有較高轉(zhuǎn)移活性的ACC-M細胞的HSPGs表達明顯高于ACC-2細胞，而且ACC-M細胞中的HSPGs合成速度與沉積于細胞外基質(zhì)的能力均明顯高于ACC-2細胞。同時在對ACC-2細胞研究中，ACC-2細胞在富含蛋白多糖的基質(zhì)中培養(yǎng)，其粘附、擴散、增殖能力均明顯增強[7]。以上研究，均提示高表達的蛋白多糖對腺樣囊性癌的惡性生物學(xué)行為有促進作用。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同亞類的HSPGs在腺樣囊性癌中的作用也不同，如GPC5在腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織中表達明顯高于未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患者，同時抑制GPC5表達，能夠明顯降低其肺轉(zhuǎn)移能力[8]。本研究以人雪旺細胞為對照，檢測HSPGs在腺樣囊性癌SACC-83細胞的表達，結(jié)果顯示不同亞類的蛋白多糖在腺樣囊性癌和周圍神經(jīng)雪旺細胞中表達水平也不盡相同，尤其SDC1與SDC4表達明顯高于人雪旺細胞。

多配體蛋白聚糖（Syndecans）作為一類跨膜HSPGs，包括SDC1、SDC2、SDC3和SDC4共4名成員，參與細胞信號通路、增殖、粘附等過程[9，10]。其中SDC1是目前研究比較多的一種，參與細胞增殖、凋亡、血管生成、遷移等過程，并通過細胞外間質(zhì)蛋白分子受體參與細胞與胞外間質(zhì)互通[11，12]，而使其廣泛表達于多種正常及腫瘤組織中[13]，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肝癌、纖維肉瘤、宮頸癌等[14~16]。在本研究中，SDC1在SACC-83細胞中表達明顯高于人雪旺細胞，且在唾液腺腺樣囊性癌腫瘤組織中表達陽性，提示其可能參與了該腫瘤的發(fā)生。而SDC4作為一種糖蛋白受體，擔(dān)任了在細胞粘附、遷移、增殖、血管生成、內(nèi)吞和轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中的重要介質(zhì)分子[17，18]，通過調(diào)節(jié)αVβ3整合素機械受體功能來控制神經(jīng)突細胞骨架收縮性[19]，作為機械傳感器，觸發(fā)整個細胞的整合素激活和粘附強化等[20]。并發(fā)現(xiàn)SDC4高表達與大腸癌[21]、乳腺癌[22，23]、肝癌[24]、骨肉瘤[25]等腫瘤的侵襲性、生存期等明顯相關(guān)，可能作為其臨床預(yù)后的判斷指標(biāo)[26]。本研究結(jié)果顯示，SDC4在腺樣囊性癌腫瘤組織中表達陽性，尤其是在伴神經(jīng)侵襲部位腫瘤細胞中表達明顯高于遠離神經(jīng)侵襲部位腫瘤細胞，提示其可能參與了腫瘤細胞的周圍神經(jīng)侵襲過程。

綜上所述，SDC1、SDC4表達于腺樣囊性癌細胞及伴神經(jīng)侵襲腫瘤組織中，尤其是SDC4蛋白可能參與了腺樣囊性癌的周圍神經(jīng)侵襲過程。這為今后的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供思路，但其具體機制還有待進一步研究。