古麗那扎爾 李倩 米娜瓦爾·胡加艾合買提 吳雷琪 阿加爾古麗·依米提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830054)

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMCs)購(gòu)自寧波明舟生物科技有限公司；平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自北京裕恒豐科技有限公司；P22phox siRNA序列(si- P22phox)、siRNA陰性對(duì)照(si-NC)、KLF4過(guò)表達(dá)載體(oe- KLF4)及其陰性對(duì)照(oe-NC)購(gòu)自武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；2xSYBR Green qPCR MasterMix購(gòu)自美國(guó)Bimake；P22phox抗體和KLF4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧處理 將凍存的HPASMCs取出，37℃溫水快速解凍，800 rpm離心3 min后，棄去細(xì)胞上清液。含10% FBS的平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，常氧組細(xì)胞置于37℃、21% O2、5% CO2、74% N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧組細(xì)胞置于37℃、3% O2、5% CO2、92% N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集常氧培養(yǎng)的細(xì)胞及缺氧處理24 h的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HPASMCs接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中每孔細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)。細(xì)胞于常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去細(xì)胞舊培養(yǎng)基，重新添加含10% FBS的平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作)、si-NC+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC和oe-NC)、si-P22phox+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-P22phox和oe-NC)和si-P22phox+oe-KLF4組(轉(zhuǎn)染si-P22phox和oe-KLF4)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HPASMCs接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中每孔細(xì)胞數(shù)量為5×103個(gè)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)1.3所示進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h。隨后根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)所示，向每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK-8溶液，細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。

1.5 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HPASMCs接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中每孔細(xì)胞數(shù)量為5×103個(gè)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)1.3所示進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h。棄去細(xì)胞舊培養(yǎng)基，加入50 μmo/L EdU的培養(yǎng)基37℃孵育2 h。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min。2 mg/mL的甘氨酸，室溫孵育5 min，PBS清洗細(xì)胞。0.5% TritonX-100室溫孵育10 min后，PBS清洗細(xì)胞。加入1×Apollo染色反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min后，棄去反應(yīng)液，加入0.5% TritonX-100清洗細(xì)胞，DAPI染核。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況。紅色熒光為EdU陽(yáng)性著色，藍(lán)色熒光為DAPI陽(yáng)性著色。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HPASMCs接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中每孔細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)。按照1.3所示進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染48 h后，用槍頭沿著直尺垂直于培養(yǎng)板劃線，PBS清洗細(xì)胞，重新加入無(wú)血清平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，顯微鏡觀察并拍照，此為0 h圖片。細(xì)胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h后，顯微鏡觀察并拍照，此為24 h圖片。Image J軟件分析細(xì)胞劃痕面積，細(xì)胞劃痕愈合率(%)=(1-劃痕面積24 h/劃痕面積0 h)×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中。無(wú)血清平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸HPASMCs，取2×104個(gè)HPASMCs接種于Transwell小室中，下室加入800 μL含10% FBS的平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基。細(xì)胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h后，取出小室，800 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min。1%結(jié)晶紫染液室溫染色20 min。PBS清洗細(xì)胞，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞P22phox和KLF4 mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的HPASMCs，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)所示，將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA。按照2xSYBR Green qPCR MasterMix使用說(shuō)明書(shū)所示，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。以GAPDH mRNA表達(dá)量為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算P22phox和KLF4 mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所需引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)所需引物序列

1.9 Western blot檢測(cè)細(xì)胞P22phox和KLF4蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的HPASMCs，加入蛋白裂解液重懸細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞30 min。12000 rpm離心20 min收集細(xì)胞上清液，BCA法測(cè)定上清液蛋白濃度。取25 μg蛋白加入加樣孔中，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% BSA室溫孵育2 h。加入P22phox抗體(1∶2000)、KLF4抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)，4℃條件下孵育過(guò)夜。加入特異性二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。PVDF膜經(jīng)清洗后，向膜上均勻滴加ECL發(fā)光液，暗室曝光。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對(duì)PASMCs增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖能力，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細(xì)胞活力顯著升高，EdU+細(xì)胞數(shù)顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 缺氧對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

2.2 缺氧對(duì)PASMCs遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 缺氧對(duì)PASMCs遷移的影響

2.3 缺氧對(duì)PASMCs中P22phox和KLF4表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中P22phox和KLF4表達(dá)，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細(xì)胞中P22phox和KLF4 mRNA表達(dá)顯著升高，P22phox和KLF4蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 缺氧對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞P22phox和KLF4表達(dá)的影響

2.4 敲低P22phox對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中KLF4表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中P22phox和KLF4表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，si-NC+oe-NC組細(xì)胞P22phox和KLF4 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，P22phox和KLF4 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與si-NC+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-NC組細(xì)胞P22phox和KLF4 mRNA表達(dá)顯著降低，P22phox和KLF4 蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)；與si-P22phox+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-KLF4組細(xì)胞P22phox mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 敲低P22phox對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中KLF4表達(dá)的影響

2.5 P22phox/ KLF4軸對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖能力，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，si-NC+oe-NC組細(xì)胞活力表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EdU+細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與si-NC+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-NC組細(xì)胞活力顯著降低，EdU+細(xì)胞數(shù)顯著降低(均P<0.05)；與si-P22phox+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-KLF4組細(xì)胞活力顯著升高，EdU+細(xì)胞數(shù)顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 P22phox/ KLF4軸對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

2.6 P22phox/ KLF4軸對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，si-NC+oe-NC組細(xì)胞劃痕愈合率和遷移細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與si-NC+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-NC組細(xì)胞劃痕愈合率和遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與si-P22phox+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-KLF4組細(xì)胞劃痕愈合率和遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 P22phox/ KLF4軸對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的影響

3 討論

PAH血管功能障礙的主要特征包括血管收縮、血管壁重塑和原位血栓形成，從而導(dǎo)致肺血管阻力增加。血管病變主要通過(guò)內(nèi)膜增生、中膜肥大、外膜增生、炎癥、血栓形成和叢狀病變的發(fā)展影響遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈[7]。缺氧誘導(dǎo)的PASMCs的過(guò)度增殖和遷移被認(rèn)為是干預(yù)PAH相關(guān)血管重塑的一個(gè)有前途的靶點(diǎn)[8-9]，因此有必要研究PASMCs增殖和遷移相關(guān)的分子機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)PAH治療靶點(diǎn)提供新的科學(xué)資料。

內(nèi)皮細(xì)胞和其他血管細(xì)胞中的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫等活性氧的一個(gè)主要來(lái)源是NOX家族。這個(gè)蛋白家族的第一個(gè)成員NOX2與P22phox一起形成細(xì)胞色素b558，作為NOX的催化核心[10]。目前的研究結(jié)果表明，對(duì)氧磷可通過(guò)上調(diào)血管中P22phox的表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[11]。Pena等[12]的研究結(jié)果顯示，慢性間歇性低壓缺氧可誘導(dǎo)大鼠心肌組織中P22phox表達(dá)上調(diào)， P22phox可能在缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。已有相關(guān)的證據(jù)顯示，P22phox在缺氧條件下可促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧誘導(dǎo)的PAH小鼠肺和心臟組織中P22phox表達(dá)增加，而敲低P22phox對(duì)低氧誘導(dǎo)的PAH小鼠具有保護(hù)作用[13]。此外，Nagaraj 等[14]的研究結(jié)果顯示，在慢性阻塞性肺疾病患者中，P22phox的表達(dá)與平均肺動(dòng)脈壓、氧合指數(shù)呈正相關(guān)。在慢性缺氧環(huán)境下，P22phox缺失與右心室功能改善和肺血管重塑減少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)HPASMCs增殖和遷移，還可上調(diào)細(xì)胞中P22phox的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低P22phox可抑制缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs增殖和遷移。該研究結(jié)果表明，P22phox可促進(jìn)缺氧條件下HPASMCs增殖和遷移，可能是治療PAH肺動(dòng)脈重塑的重要靶點(diǎn)。

KLF4與許多重要的細(xì)胞過(guò)程有關(guān)，如細(xì)胞增殖、分化和炎癥等其他生物學(xué)活動(dòng)[15]。以前的研究已經(jīng)證明，KLF4參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移能力[16]。下調(diào)細(xì)胞中KLF4的表達(dá)可抑制血管平滑肌細(xì)胞異常增殖和遷移[17-18]。目前，已有證據(jù)顯示，長(zhǎng)期缺氧可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖速度大于凋亡，最終導(dǎo)致不可逆的肺血管重塑[19]。而在缺氧條件下血管平滑肌細(xì)胞中KLF4表達(dá)增加，敲低KLF4可抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移[20]。目前，已有相關(guān)研究證明，KLF4在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動(dòng)脈中表達(dá)上調(diào)，敲低KLF4可以預(yù)防和改善大鼠PAH的進(jìn)展[21]。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中KLF4表達(dá)上調(diào)。另外，已有研究表明，敲低P22phox通過(guò)下調(diào)KLF4表達(dá)抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[22]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中，敲低P22phox可下調(diào)細(xì)胞中KLF4表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)KLF4可逆轉(zhuǎn)敲低P22phox對(duì)缺氧HPASMCs的作用，促進(jìn)HPASMCs增殖和遷移。本研究結(jié)果還表明，P22phox可通過(guò)上調(diào)KLF4表達(dá)促進(jìn)缺氧條件下HPASMCs增殖和遷移，P22phox/ KLF4軸可能是治療PAH肺動(dòng)脈重塑的重要靶點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)HPASMCs增殖和遷移，還可上調(diào)HPASMCs中P22phox和KLF4的表達(dá)。P22phox可通過(guò)上調(diào)KLF4表達(dá)促進(jìn)缺氧條件下HPASMCs增殖和遷移。該研究結(jié)果為明確PAH血管重塑分子機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的PAH治療靶點(diǎn)提供了新的科學(xué)依據(jù)。