吳文明 趙汝崗 張強

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院骨科，中國 北京 100015)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少，骨質(zhì)量受損及骨強度降低，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病。由于人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率逐漸增加[1-2]。因此，需探討骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展的作用機制，尋找治療骨質(zhì)疏松癥的新策略。氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用，影響骨形成相關(guān)細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展。因此，抗氧化應(yīng)激對預(yù)防骨質(zhì)疏松癥具有重要意義[3-4]。lncRNA與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，還參與調(diào)控骨代謝相關(guān)信號通路，將可為骨質(zhì)疏松癥診斷、治療及判斷預(yù)后提供新的靶向目標(biāo)[5-6]。有研究報道，人炎癥牙周膜干細(xì)胞中Linc01135表達(dá)降低，上調(diào)Linc01135可促進(jìn)人炎癥牙周膜干細(xì)胞在12%靜態(tài)牽張力作用下的成骨分化[7]。然而Linc01135對成骨細(xì)胞增殖分化及氧化應(yīng)激的影響及機制尚不清楚。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展，p38MAPK是MAPK信號通路的一種，p38MAPK可以通過磷酸化相關(guān)成骨轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控成骨細(xì)胞基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其功能[8-9]?；罨痯38 MAPK通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]。葛根素通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2和p38MAPK信號通路刺激成骨分化和骨形成[11]。但p38MAPK信號通路對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響尚不清楚。本研究用過氧化氫作用的成骨細(xì)胞，以模擬體外骨質(zhì)疏松的病理環(huán)境，旨在探討Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞增殖分化及氧化應(yīng)激損傷的影響及其機制是否與p38 MAPK信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細(xì)胞hFOB 1.19購自上海晅科生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自美國Hyclone公司；p38MAPK抑制劑(SB203580)購自北京百奧萊博科技有限公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自廈門研科生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、總抗氧化能力(Total antioxidantcapacity，T-AOC)、丙二醛(Malonaldehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；熒光定量RT-qPCR試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組 人成骨細(xì)胞hFOB 1.19用含15%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將其分為Con組、H2O2組、H2O2+pcDNA組、H2O2+pcDNA-Linc01135組及H2O2+pcDNA-Linc01135+SB203580組。正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組；0.1 mmol/L H2O2處理的細(xì)胞作為H2O2組，將pcDNA、pcDNA-Linc01135分別轉(zhuǎn)染至hFOB 1.19中，再用0.1 mmol/L H2O2處理，記為H2O2+pcDNA組和H2O2+pcDNA-Linc01135組；將pcDNA-Linc01135轉(zhuǎn)染至hFOB 1.19中，再加入10 μM SB203580和0.1 mmol/L H2O2處理，記為H2O2+pcDNA-Linc01135+SB203580組。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處吸光度(OD)值，即代表細(xì)胞活力。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，離心棄上清；重懸細(xì)胞后加入預(yù)冷的80%乙醇，4℃固定過夜；PBS洗滌3次，加入核糖核酸酶A(RNase A)，37℃孵育30 min，加入碘化啶(PI)染色液，4℃染色15 min，上機檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測Runx2、OCN、Cleaved-caspase3、Pro-caspase3、p-p38MAPK蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行定量。各組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF上。用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，用Quantity One軟件測定各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用冷PBS漂洗2次，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 SOD活性、T-AOC及MDA含量的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Linc01135表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Linc01135以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴增，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。Linc01135上游引物序列：5′-CTCATAAATACATA CAGCCCAC-3′，下游引物序列：5′-GAGATTCCTCA TAGAAATAGCC-3′；β-actin上游引物序列：5′-CTA CAATGAGCTGCGTGTGG-3′，下游引物序列：5′-A AGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。

2 結(jié)果

2.1 Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞增殖分化的影響 與Con組相比，H2O2組和H2O2+pcDNA組細(xì)胞OD值降低，G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，Runt相關(guān)基因2(Runx2)、骨鈣素(OCN)蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與H2O2組和H2O2+pcDNA組相比，H2O2+pcDNA-Linc01135組細(xì)胞OD值升高，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞中Runx2、OCN蛋白表達(dá)的影響

表1 Linc01135對成骨細(xì)胞增殖分化的影響

2.2 Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與Con組相比，H2O2組和H2O2+pcDNA組細(xì)胞凋亡率升高，活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase3)表達(dá)水平升高，caspase3前體(Pro-caspase3)表達(dá)水平降低，T-AOC及SOD活性降低，MDA含量升高(均P<0.05)；與H2O2組和H2O2+pcDNA組相比，H2O2+pcDNA-Linc01135組細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，Pro-caspase3表達(dá)水平升高，T-AOC及SOD活性升高，MDA含量降低(均P<0.05)，見圖2、表2。

表2 Linc01135對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

圖2 Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞凋亡及caspase3蛋白表達(dá)的影響

2.3 Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞中p38MAPK信號通路的影響 與Con組相比，H2O2組和H2O2+pcDNA組Linc01135表達(dá)水平降低，p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與H2O2組和H2O2+pcDNA組相比，H2O2+pcDNA-Linc01135組Linc01135表達(dá)水平升高，p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)，見圖3、表3。

表3 Linc01135對成骨細(xì)胞p38MAPK信號通路的影響

圖3 p-p38MAPK蛋白的表達(dá)

2.4 p38MAPK信號通路阻斷劑可減弱Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞增殖分化的影響 與H2O2+pcDNA-Linc01135組相比，H2O2+pcDNA-Linc01135+SB203580組細(xì)胞OD值降低，G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)，見圖4、表4。

圖4 SB203580可減弱Linc01135成骨細(xì)胞中Runx2、OCN蛋白表達(dá)的影響

表4 SB203580可減弱Linc01135成骨細(xì)胞增殖分化的影響

2.5 p38MAPK信號通路阻斷劑可減弱Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與H2O2+pcDNA-Linc01135組相比，H2O2+pcDNA-Linc01135+SB203580組細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，Pro-caspase3表達(dá)水平降低，T-AOC及SOD活性降低，MDA含量升高(均P<0.05)，見圖5、表5。

圖5 SB203580可減弱Linc01135成骨細(xì)胞凋亡及caspase3蛋白表達(dá)的影響

表5 SB203580可減弱Linc01135成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種全身性骨骼疾病，骨形成不足或骨量丟失是其發(fā)病的重要原因，成骨細(xì)胞是骨形成的重要細(xì)胞，增強成骨細(xì)胞的骨形成是治療骨質(zhì)疏松癥的理想策略[12]。骨量的丟失與氧化應(yīng)激有關(guān)，且氧化應(yīng)激可抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)展[13-14]。過氧化氫可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和功能障礙，造成氧化損傷[15-16]。本實驗用過氧化氫作用成骨細(xì)胞后細(xì)胞OD值降低，G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，Pro-caspase3表達(dá)水平降低，T-AOC及SOD活性降低，MDA含量升高。Runx2和OCN是成骨細(xì)胞活性及分化的指標(biāo)，其高表達(dá)促進(jìn)成骨分化[17-18]。SOD是抗氧化酶，可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)；MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可反應(yīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[19]。本研究結(jié)果表明，過氧化氫可抑制成骨細(xì)胞增殖、分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，體外骨質(zhì)疏松模型建立成功。

lncRNA參與骨質(zhì)疏松的發(fā)展過程，影響成骨細(xì)胞增殖分化等，如lncRNA NEAT1可抑制成骨細(xì)胞分化誘發(fā)骨質(zhì)疏松[20]。lncRNA AK045490通過β-catenin/T細(xì)胞因子1(T cell factor-1，TCF1)/Runx2信號軸促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成[21]。上調(diào)Linc01135可促進(jìn)人炎癥牙周膜干細(xì)胞成骨分化[7]。本實驗結(jié)果顯示，過氧化氫作用的成骨細(xì)胞中Linc01135表達(dá)水平降低，過表達(dá)Linc01135后成骨細(xì)胞中細(xì)胞OD值升高，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，Pro-caspase3表達(dá)水平升高，T-AOC及SOD活性升高，MDA含量降低。這表明過表達(dá)Linc01135可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制過氧化氫誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

細(xì)胞松弛素D可上調(diào)Runx2、OCN和OSX的表達(dá)，通過p38-MAPK信號通路促進(jìn)MC3T3細(xì)胞的成骨分化[22]。淫羊藿次苷Ⅱ可通過p38MAPK信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[23]。檸檬烯通過激活p38MAPK和蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)信號通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和葡萄糖攝取[24]。以上研究表明，激活p38MAPK信號通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。有研究報道，lncRNA MALAT1可通過p38MAPK途徑促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激[25]。本實驗結(jié)果顯示，過氧化氫作用的成骨細(xì)胞中p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平降低，過表達(dá)Linc01135可提高p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平，表明過表達(dá)Linc01135可能活化p38MAPK信號通路。本實驗還發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路阻斷劑可減弱Linc01135對過氧化氫作用的成骨細(xì)胞增殖分化及氧化應(yīng)激損傷的影響。Linc01135可能通過p38MAPK信號通路影響成骨細(xì)胞增殖分化及氧化應(yīng)激。

4 結(jié)論

過表達(dá)Linc01135可能通過激活p38MAPK信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制過氧化氫作用的成骨細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷。