覃浩然 宋泉生 覃海飚 鐘遠(yuǎn)鳴 付拴虎 谷金 盧大漢 陳勇喜

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨一科，廣西 南寧 530023)

股骨頭壞死的治療一直是臨床骨科的主要問題，治療周期長且困難，給患者的生理、心理和財務(wù)狀況帶來了巨大負(fù)擔(dān)[1- 2]。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞研究的進(jìn)展，多能干細(xì)胞已成為重要的種子細(xì)胞，而骨髓基質(zhì)細(xì)胞是髓內(nèi)多能基質(zhì)細(xì)胞，可以分化為成年細(xì)胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等[3]。這些細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)分子和細(xì)胞因子(膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白，白介素-3/6/8，MCS-F和血小板生成素)，不僅有促進(jìn)局部造血作用，而且還有效促進(jìn)骨修復(fù)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞不僅易于管理，而且不會引起自身免疫反應(yīng)。因此，如何有效促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化成為骨損傷相關(guān)疾病治療的熱點(diǎn)。

柚皮苷屬于類黃酮，是重要的次生代謝產(chǎn)物，是水果中發(fā)現(xiàn)的生物活性化合物，廣泛分布在植物來源的食物，如蔬菜、水果、茶和葡萄酒等[4]。這些植物、藥物因其不易上癮且無毒的性質(zhì)，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有重要意義。有研究表明，柚皮苷具有抗氧化、抗白內(nèi)障、抗微生物、抗誘變、抗癌、抗炎和降低膽固醇的作用[5-7]。進(jìn)一步的研究還表明，柚皮苷的配方可促進(jìn)骨骼再生，并具有預(yù)防PM10引起的肺損傷的作用[8]。柚皮苷口服或直接與骨髓基質(zhì)細(xì)胞注射對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損具有修復(fù)作用[9]。但柚皮苷是否影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和遷移依然不太清晰，故本研究旨在探討柚皮苷對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和遷移的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)均購自GIBIC(USA)；柚皮苷(阿拉丁，中國)；十六烷基氯化吡啶鎓(CPC，Sigma，USA)；RNA提取試劑(Takara，中國)；CCK-8試劑盒(MCE，中國)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(南京建成，中國)；茜素紅S(ARS)染色(上海歌凡生物，中國)；anti-OPG、anti-RANKL、anti-OCN、anti-β-Actin(Abcam，USA)；結(jié)晶紫染色液(碧云天，中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 提取兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)[10]：選用2～3月齡新西蘭大白兔，戊巴比妥鈉麻醉，酒精消毒，切開兩側(cè)股骨和脛骨，用含有5 mL生理鹽水和肝素(100 μL/mL)的20 mL注射器抽取骨髓，收集細(xì)胞懸液于離心管。1500 r/m離心10 min，棄上清，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打均勻，細(xì)胞計數(shù)，接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日換一次液，待細(xì)胞長至80%時，胰酶消化傳代，待細(xì)胞長至第3代則開始用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活性測量 將兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞以每孔1000個細(xì)胞的密度接種在96孔板中。然后用不同濃度的柚皮苷(0、5、10、25、50、100、1000 μM)處理細(xì)胞48 h。根據(jù)CCK-8試劑盒說明，每孔加入10% CCK-8液，繼續(xù)孵育1 h，于450 nm處的吸光度測量細(xì)胞活力。

1.4 ALP活性 將兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞以3×104/cm2的密度接種到12孔板中，然后用不同濃度的柚皮苷(0、10、25、50 μM)處理細(xì)胞48 h。然后將板用PBS洗滌3次，根據(jù)制造商的說明使用ALP活性測定法確定ALP活性。

1.5 ARS染色 將兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞用不同濃度的柚皮苷(0、10、25、50 μM)處理細(xì)胞48 h，根據(jù)制造商的說明ARS染色。首先，在室溫下將樣品在4%多聚甲醛中固定30 min。用PBS洗滌3次后，使用0.5%ARS(PH 4.1)染色細(xì)胞。然后，將兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞再次用PBS洗滌3次，并使用10%的CPC提取鈣沉積物。然后通過測量560 nm處的吸光度對進(jìn)行定量。

1.6 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 將兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞每孔4×104個細(xì)胞的密度接種在6孔板中，然后使用無菌微量移液器吸頭從6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一端到另一端刮擦細(xì)胞層。然后用不同濃度的柚皮苷(0、10、25、50 μM)處理細(xì)胞48 h，于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7 細(xì)胞結(jié)晶紫染色 將Transwell小室置于24孔板，用含不同濃度柚皮苷的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并以3×104/cm2的密度接種到Transwell上室。下室中加入含10% FBS的培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。吸棄上室中的細(xì)胞，將小室置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定30 min，隨后用0.01%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，用PBS漂洗3次。顯微鏡拍照觀察，ImageJ圖像軟件計數(shù)，并計算細(xì)胞遷移率。

1.8 實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞以每孔4×104個細(xì)胞的密度接種在6孔板中。細(xì)胞達(dá)到80%后，用不同濃度的柚皮苷(0、10、25、50 μM)處理細(xì)胞48 h。使用RNAiso試劑提取細(xì)胞總RNA。然后，根據(jù)制造商的說明使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara，日本)通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，qPCR使用ABI Step One Plus實(shí)時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Warrington，英國)。將反應(yīng)循環(huán)設(shè)置為95℃ 30 s，然后將95℃ 5 s和60℃ 30 s設(shè)置為45個循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)使用GAPDH作為內(nèi)參基因，并通過2-ΔΔCt方法表示目標(biāo)基因的相對表達(dá)。引物序列如下：OPG Forward 5′-TACAGCATCACT ACGTAGGAC-3′，OPG Reverse 5′-ACGTCATGCG ATCACATATCG-3′；RANKL Forward 5′-GACAG GCACGGACTCGTA-3′，RANKL Reverse 5′- CGCT CATGCTAGTCGTCTA-3′；Runx2 Forward 5′-AGCG CTTCTCAGGAGTTCCA-3′，Runx2 Reverse 5′-GCCG GGCCACATCGA-3′；OCN Forward 5′-CTGGCTG CGCTCTGTCTCT-3′，OCN Reverse 5′-TGCTTGG ACATGAAGGCTTTG-3′；GADPH Forward 5′-CA ACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，GADPH Reverse 5′-ACACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。

1.9 蛋白免疫印跡(Western blot) 使用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA測定試劑盒蛋白定量。用15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，將膜與相應(yīng)抗體于4℃孵育過夜：抗OPG(1∶1000稀釋)，抗RANKL(1∶1000稀釋)，抗RunX2(1∶1000稀釋)，抗OCN(1∶1000稀釋)和β-Actin(1∶1000稀釋)。將膜用TBST洗滌，然后與HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育45 min。用化學(xué)發(fā)光檢測試劑檢測，用ImageJ圖像軟件分析相對蛋白水平，并根據(jù)β-Actin進(jìn)行歸一化。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞活性測量結(jié)果表明，與0 μM組比較，柚皮苷100 μM和1000 μM明顯抑制細(xì)胞活性，但50、25、10、5 μM對細(xì)胞活性無影響，因此后續(xù)采用柚皮苷50 μM、25 μM和10 μM進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，見圖1。

圖1 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞活性的影響

2.2 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響 ALP染色結(jié)果表明，與0 μM組比較，柚皮苷25 μM和50 μM組細(xì)胞中ALP活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見圖2A～B。ARS染色結(jié)果同樣表明，與0 μM組比較，柚皮苷25 μM和50 μM組細(xì)胞有明顯的鈣沉積物形成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2C～D。

圖2 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響

2.3 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕和結(jié)晶紫染色結(jié)果表明，與0 μM組比較，柚皮苷10 μM、25 μM和50 μM組細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，且隨濃度升高而增強(qiáng)，呈濃度依賴性(均P<0.05)，見圖3。

圖3 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

2.4 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG和RANKL相關(guān)基因表達(dá)的影響 與0 μM組比較，柚皮苷處理組細(xì)胞中OPG、Runx2和OCN mRNA水平明顯上調(diào)，且呈濃度依賴性。但柚皮苷處理組細(xì)胞中RANKL mRNA水平較0 μM組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。

圖4 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG/RANKL相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG和RANKL相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與0 μM組比較，柚皮苷處理組細(xì)胞中OPG、Runx2和OCN蛋白水平明顯上調(diào)，且呈濃度依賴性。但柚皮苷處理組細(xì)胞中RANKL蛋白水平較0 μM組明顯下調(diào)(均P<0.05)，見圖5。

圖5 柚皮苷對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG和RANKL相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

股骨頭壞死主要是由于臨床長期大劑量使用類固醇激素治療，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤以及其他炎性和自身免疫性疾病引起的嚴(yán)重并發(fā)癥[11]。隨著疾病的進(jìn)展，病變逐漸涉及關(guān)節(jié)和骨髓，然后在晚期發(fā)展為股骨頭塌陷和髓樣骨關(guān)節(jié)炎，導(dǎo)致難以忍受的疼痛，折斷甚至殘疾。當(dāng)疾病嚴(yán)重到一定程度時，通常需要進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)以確保關(guān)節(jié)的正常功能和減輕癥狀[12]。但手術(shù)費(fèi)用昂貴，且二次手術(shù)風(fēng)險較高，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。深入分析股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理以及開發(fā)相應(yīng)的新藥對于緩解患者的壓力非常重要[13]。到目前為止，雖然尚不清楚股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理，但主要的機(jī)制理論集中于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化穩(wěn)態(tài)過程。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞是機(jī)體骨髓中的一類多功能干細(xì)胞，可用作種子細(xì)胞以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[14]。越來越多的證據(jù)表明，股骨頭壞死患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化能力下降，而脂肪形成分化能力增強(qiáng)，這導(dǎo)致細(xì)胞組織的供血和供氧不足，促進(jìn)細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡，然后導(dǎo)致股骨頭壞死的惡性循環(huán)[15]。因此，提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和遷移有望成為股骨頭壞死治療的新策略。口服柚皮苷在骨關(guān)節(jié)炎模型中具有治療軟骨破壞的潛力[16]。柚皮苷也能夠調(diào)節(jié)炎癥性蛋白分泌并促進(jìn)軟骨細(xì)胞浸潤[17]。柚皮苷能夠促進(jìn)骨骼再生以及口服或直接與骨髓基質(zhì)細(xì)胞注射對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損具有修復(fù)作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能夠直接促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化和遷移。

本研究選擇茜素紅S染色和ALP染色評價骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化能力。其中，ALP是一種膜結(jié)合酶，可以水解有機(jī)磷酸鹽以釋放無機(jī)磷并開始鈣化過程，標(biāo)志著成骨細(xì)胞分化的開始。茜素紅S可以與鈣離子螯合形成復(fù)合物，識別細(xì)胞中的鈣鹽成分，并標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化形成的鈣結(jié)節(jié)。根據(jù)染色結(jié)果，柚皮苷誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中茜素紅S染色和ALP染色均為陽性，且染色強(qiáng)度具有濃度依賴性。另外，柚皮苷與骨髓基質(zhì)細(xì)胞合用能夠促進(jìn)膝關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨修復(fù)[19]。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，柚皮苷可以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。另外，骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移至骨損傷部位是骨修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，柚皮苷也能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的遷移能力。

成骨細(xì)胞是骨代謝中最重要的細(xì)胞之一，骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化過程涉及許多信號通路。柚皮苷通過轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路促進(jìn)大鼠軟骨組織修復(fù)[20]。柚皮苷也能夠通過影響NF-κB信號通路緩解骨關(guān)節(jié)炎大鼠基質(zhì)破壞[17]。柚皮苷通過抑制NF-кB信號通路的活化來逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨抑制[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷通過調(diào)控OPG/RANKL信號通路直接促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和遷移。

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)與骨重塑緊密相關(guān)，對調(diào)節(jié)骨代謝平衡至關(guān)重要。RANKL作為配體的腫瘤壞死因子(TNF)超家族的一員，主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并以膜結(jié)合的形式存在于細(xì)胞表面，對淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和破骨細(xì)胞活化至關(guān)重要。RANK是破骨前體細(xì)胞中RNAKL唯一的受體，可以直接與RANKL結(jié)合，RANK可以與TRAF2，TRAF5和TRAF6結(jié)合，其中TRAF6與破骨細(xì)胞的產(chǎn)生密切相關(guān)，可通過NF-κB、JNK、蛋白質(zhì)激酶B(PKB)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞的核因子(CN/NFATcl)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的分化、活化、成熟以及組織細(xì)胞凋亡。OPG作為腫瘤壞死因子受體超家族的成員，是成骨細(xì)胞分化的誘餌受體，可以與RANKL競爭并抑制RANKL和RANK之間的相互作用，從而阻礙了成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞前體的分化和融合，同時調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，增殖和凋亡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷呈依賴性促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG表達(dá)，且抑制RANKL表達(dá)水平，這說明柚皮苷的促骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化能力與調(diào)控OPG/RANKL信號通路有關(guān)。目前認(rèn)為干細(xì)胞向特定細(xì)胞系的分化主要是由特定的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的。RUNX2是骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以直接促進(jìn)成骨細(xì)胞分化所需的基因(如OCN和COL1A1)的合成和分泌[22]。COL1A1是骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分，可以控制骨細(xì)胞的形態(tài)、分化和其他生物學(xué)功能，在維持骨骼結(jié)構(gòu)的完整性和生物力學(xué)特性方面起著重要作用。OCN是骨骼鈣化的重要因素，在維持正常礦化中起關(guān)鍵作用，并且是成骨晚期分化的標(biāo)志之一。通常RUNX2，OCN和COL1A1的表達(dá)降低表明細(xì)胞的成骨分化減少，而這些指標(biāo)的表達(dá)升高則提示成骨分化能力增強(qiáng)[23]。本研究結(jié)果顯示，柚皮苷明顯上調(diào)骨髓基質(zhì)細(xì)胞RUNX2和OCN表達(dá)。

4 結(jié)論

柚皮苷能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和遷移能力，這可能與調(diào)控OPG/RANKL信號通路有關(guān)，暗示柚皮苷可能具有抗股骨頭壞死的潛在活性。但柚皮苷抗股骨頭壞死的活性和機(jī)制還需更進(jìn)一步研究。