賀芳 趙明剛 李翠 拓園 王翔

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心·陜西省遺傳病診斷中心，陜西 西安 710061；2.北京安博迪恩生物技術(shù)有限公司，北京 100000)

耳聾是最常見的出生缺陷之一,截止2017年12月31日，全國殘疾人人口基礎(chǔ)庫主要數(shù)據(jù)顯示(http://www.cdpf.org.cn/)，陜西省總殘疾人1298496，占全國總殘疾人的3.8%，其中聽力言語殘疾占總殘疾人數(shù)的11.7%。耳聾與諸多因素有關(guān),如遺傳、感染、噪聲、創(chuàng)傷、耳毒性藥物等，最主要因素為遺傳和環(huán)境,前者占50%以上，約70%的遺傳性耳聾為非綜合征型聾(Nonsyndromic hearing loss,NSHL)[1]。截止2020年2月5日，已確定的非綜合征性聽力損失基因多達123個(https://he-reditaryhearingloss.org/)，且具有高度的遺傳異質(zhì)性及表型多樣性。目前，我國遺傳性耳聾研究多集中于新發(fā)突變位點的發(fā)現(xiàn)[2]與孕婦及新生兒的常見遺傳性耳聾基因篩查上[3-4]。在以下方面尚存在不足：①對非綜合征性耳聾患者的基因研究較少。②缺乏針對不同人群，不同地域進行個性化遺傳性耳聾篩查策略。③臨床耳聾遺傳咨詢工作尚缺乏落地有效個性化遺傳咨詢策略及方法。鑒于以上，本研究選取西安地區(qū)的246例耳聾患者進行相關(guān)遺傳性耳聾基因篩查，以摸索出更適合西安地區(qū)非綜合征聾人群體的基因篩查策略，并根據(jù)結(jié)果對不同個體提供個性化的遺傳咨詢。

1 對象與方法

1.1 對象 選取西安市一所聾啞學(xué)校、一所聾啞協(xié)會2014年11月～2018年3月遺傳咨詢門診接診的非綜合征型耳聾患者，共計246例?；颊?～64歲，平均(23.8±8.1)歲；男性125例，女性 121例；按照醫(yī)院倫理委員會管理規(guī)定由患者監(jiān)護人(18歲以下)或本人簽署知情同意書后，采集靜脈血2mL，EDTA管抗凝，-20℃保存，備用。

1.2 檢測內(nèi)容 依據(jù)微陣列芯片雜交技術(shù)，對人群中常見的4個基因GJB2、SLC26A4、線粒體12sRNA、GJB3，9個突變位點:235delC、35delG、176del16、299delAT、2168A>G、IVS7-2、1494C>T、1555A>G、538C>T進行基因篩查。GJB2、SLC26A4基因全外顯子測序。

1.3 DNA的提取 根據(jù)DNA提取試劑盒(康為CW5044S)中的操作流程，提取耳聾患者外周血標(biāo)本中DNA，用核酸蛋白濃度分析儀SmartSpec Plus(Bio-Rad，美國)檢測DNA質(zhì)量 (濃度80～180 ng/μL、OD值1.7～2.0)，放入-20℃冰箱，待用。

1.4 PCR擴增 在PCR試劑準(zhǔn)備區(qū)，按照9項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(微陣列芯片法)配置PCR體系、進行擴增。

1.5 雜交及其芯片掃描 在PCR產(chǎn)物分析區(qū)，將14.5μL雜交混合液加入芯片點樣孔中，封閉雜交盒，60℃孵育1 h。之后在芯片洗干儀(晶芯?SlideWasherTM，博奧)中洗滌并甩干芯片，于微陣列芯片掃描儀(晶芯?LuxScanTM10K/B，博奧)中進行芯片掃描。

1.6 家系調(diào)查分析及遺傳咨詢 對基因芯片檢出為陽性的患者，建議其父母及兄弟姐妹進行此項篩查。對雜合突變及野生型個體，建議其行相關(guān)突變基因的全外顯子測序，同時針對以上結(jié)果，制作遺傳性耳聾基因識別卡片，為不同個體提供個性化遺傳咨詢。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。利用Deaftest系統(tǒng)對芯片掃描結(jié)果進行分析。同時運用EXCEL2007建立患者的信息數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 224例耳聾患者以GJB2和SLC26A4基因突變?yōu)橹?本研究對246例耳聾患者進行遺傳性耳聾基因篩查，在篩查的4個常見突變基因中，分別檢出GJB2和SLC26A4基因突變43例(17.48%)、35例(14.23%)。發(fā)現(xiàn)線粒體12SrRNA突變7例(2.85%)，且均為1555A>G均質(zhì)突變。GJB3基因未檢出突變，見圖1。

圖1 246例聾啞患者遺傳性耳聾基因突變的發(fā)生率

2.2GJB2和SLC26A4基因突變位點的多樣性 在檢出的43例GJB2基因突變患者中，存在9種突變類型(表1)，其中純合及復(fù)合雜合突變26例(60.47%)，雜合突變17例(39.53%)。另在35例SLC26A4基因突變個體中，檢出5種突變類型，其中純合及復(fù)合雜合突變12例(34.29%)，雜合突變23例(65.71%)。

表1 GJB2和SLC26A4基因突變位點檢出率

2.3 家系調(diào)查結(jié)果以GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者為主 對17個家系中的56人進行了遺傳性耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)在39例家系成員中，GJB2、SLC26A4基因突變攜帶者占比48.72%(19/39)。GJB2基因突變頻率35.90%(14/39)，其中以235delC、 299delAT突變?yōu)橹?；SLC26A4基因突變頻率為20.51%(8/39)，其中以IVS7-2A>G、2168A>G突變?yōu)橹?。另檢出1例線粒體12sRNA1555均質(zhì)突變型成員，見表2。

表2 17個家系56例成員的家系調(diào)查結(jié)果

2.4GJB2和SLC26A4基因全外顯子測序分析，除檢出基因芯片包含突變位點外，還額外發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變位點。在遺傳咨詢中，結(jié)合咨詢者的愿望及需求，對兩對欲生育正常聽力后代的年輕聾啞夫婦，兩個已育有聾兒的家庭(欲再生育聽力正常后代)，和2例芯片篩查為野生型的耳聾患者，共12人進行了GJB2和SLC26A4基因全外顯子序列分析，并將測序結(jié)果與基因芯片結(jié)果進行比對(表3)，在基因芯片檢測范圍內(nèi)，GJB2和SLC26A4基因全序列分析結(jié)果與之一致。另有4例耳聾患者在GJB2基因的c.605ins46，c.79G>A，c.341A>G，c.257C>G，c.109G>A位點發(fā)生突變。

表3 12例樣本基因芯片結(jié)果及GJB2和SLC26A4基因全外顯子序列分析結(jié)果

2.5 遺傳咨詢 針對以上結(jié)果，為患者提供遺傳性耳聾基因識別卡片(圖2)，為不同需求的患者提供婚育、用藥、治療、預(yù)防等個性化遺傳咨詢。

圖2 遺傳性耳聾基因識別卡片

3 討論

在我國GJB2,SLC26A4,mtDNA12SrRNA基因是遺傳性聾高發(fā)的基礎(chǔ),這些致聾基因所致的遺傳性聾有著較高的發(fā)病率[5-6], 但也存在地域差異[7-10]。在對西北地區(qū)耳聾患者的基因篩查中[11]，發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4基因的突變頻率分別為16.12%、10.54%，其中以235delC突變最為常見，占GJB2突變等位基因的65.71%。而在福建省107例非綜合征聽力損失人群基因檢測研究中[12]，GJB2基因突變占17.76%,其中以235delC、299delA為主。河南地區(qū)遺傳性耳聾基因篩查數(shù)據(jù)顯示[13]，GJB2基因突變頻率28.46%，SLC26A4基因突變頻率為 20.77%。本研究中，西安市246例非綜合征型耳聾患者遺傳性耳聾基因篩查數(shù)據(jù)顯示，GJB2和SLC26A4基因突變發(fā)生率分別為17.48%、14.23%，而GJB2基因突變中發(fā)生率較高的位點有：235delC、299delA；SLC26A4基因突變發(fā)生率較高的位點有2168A>G、IVS7-2。該數(shù)據(jù)略高于西北地區(qū)GJB2、SLC26A4基因的突變頻率，與福建省篩查數(shù)據(jù)相近，低于河南省GJB2、SLC26A4基因的突變頻率。2019年，國內(nèi)已出臺了針對孕婦和新生兒的遺傳性耳聾基因變異篩查技術(shù)專家共識[14]，而針對非綜合征性耳聾患者的基因突變篩查并未制定，本研究可為完善該人群聾病基因篩查提供一定的數(shù)據(jù)支持。

本研究對12例樣本GJB2和SLC26A4基因的全序列分析與基因芯片結(jié)果對比后發(fā)現(xiàn)，在基因芯片檢測范圍內(nèi)，測序結(jié)果與之一致。另外在檢測范圍之外，有4例患者存在其他突變類型，分別為：c.235delC/ c.605ins46復(fù)合雜合突變、c.235delC雜合/c.79G>A雜合/c.341A>G雜合、c.GJB2 257C>G/ c.299delAT復(fù)合雜合突變、c.GJB2 109G>A純合突變。分析以上額外發(fā)現(xiàn)的突變位點后，發(fā)現(xiàn)曾在2004年的學(xué)術(shù)交流會中，有報道過一例新生兒GJB2基因c.235delC/c.605ins46突變[15]，但對c.605ins46的致病性之后鮮少報道。2018年，在一個中國家庭中，發(fā)現(xiàn)c.257C>G/c.176del16復(fù)合雜合突變，而提出該位點的突變可能與該家系的聽力損失有關(guān)[16]。c.109G>A，c.79G>A,c.341A>G,突變在非綜合征型聾人中的發(fā)生頻率遠高于正常聽力人群，在流行病學(xué)意義上屬于致聾的危險因素[17-19]，可作為人群針對性的耳聾基因檢測在臨床上予以重視?？傊陨衔稽c的額外檢出，可以為其致病基因位點研究提供臨床數(shù)據(jù)。同時，這也提示基因芯片篩查在檢測內(nèi)容上存在局限性，針對耳聾人群在排除遺傳因素致病方面應(yīng)盡可能選擇位點更多，范圍更廣的檢測手段。但聾病基因篩查的大范圍推廣還有賴于較低的篩查成本，因此在西安地區(qū)，相較成本較高的基因全外顯子序列分析技術(shù)，基因芯片篩查以高通量、低成本、高準(zhǔn)確率為特征，適時的選擇兩者的結(jié)合在臨床應(yīng)用中為一種更好的策略。

在我國聾人群體中，聾聾結(jié)合是最常見的婚配模式。根據(jù)前期調(diào)查，21%聾人夫婦因相同基因突變致聾，其后代發(fā)生聾病幾率達100%，且無法通過產(chǎn)前診斷或者胚胎植入前診斷預(yù)防。遺傳性耳聾因其高度遺傳異質(zhì)性、表型多樣性[20]，而使臨床遺傳咨詢具有高度復(fù)雜性。本研究針對不同個體提出了個性化的遺傳咨詢策略，為臨床遺傳性耳聾患者的遺傳咨詢提供了參考數(shù)據(jù)：①本研究中，表3中的聾兒家庭1，夫婦耳聾基因篩查均為GJB2 235delC雜合突變，育有一子，基因篩查結(jié)果為GJB2 235delC純合突變。該對夫婦欲再生育聽力正常后代，后行GJB2基因全序列分析顯示，父親GJB2基因c.235delC, c.79G>A, c.341A>G位點均存在雜合突變。鑒于以上，該對夫婦生育耳聾及攜帶者后代的風(fēng)險較高，建議其借助輔助生殖技術(shù)，達到生育聽力正常后代的愿望。②1例耳聾患兒(表2，家系15)，6歲，五年前發(fā)現(xiàn)聽力進行性下降，3歲多時植入人工耳蝸，現(xiàn)語言發(fā)育可，基因篩查顯示為SLC26A4基因IVS7-2A>G/2168A>G復(fù)合雜合突變，家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)其母親為SLC26A4 2168A>G雜合突變，父親為SLC26A4 IVS7-2A>G雜合突變，遺傳咨詢中告之其再生育耳聾后代的風(fēng)險為25%。隨訪中得知該母親已孕21周，隨建議其對胎兒進行遺傳性耳聾基因的產(chǎn)前診斷，結(jié)果顯示胎兒仍為“SLC26A4基因IVS7-2A>G/2168A>G復(fù)合雜合突變”，進行過詳細的遺傳咨詢后，該對夫婦自愿選擇終止妊娠，有效避免了聾兒的出生。③線粒體基因1555A>G和1494C>T的突變，可導(dǎo)致藥物敏感性耳聾，攜帶該位點突變的個體，對氨基糖苷類藥物(如：慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素及丁胺卡那霉素等)異常敏感，通常很小的使用劑量就可能導(dǎo)致耳聾癥狀的出現(xiàn)。因此在本研究中，對檢出的7例1555A>G均質(zhì)突變個體，均發(fā)放“遺傳性耳聾基因識別卡片”，囑其在以后就診時主動向醫(yī)師出示該卡片，以避免相關(guān)藥物的使用。同時追蹤母系成員，進行用藥指導(dǎo)，以實現(xiàn)聾病的一級預(yù)防。④在門診咨詢中，對確診為遺傳性耳聾的患者或攜帶者，在擇偶時應(yīng)指導(dǎo)其避免選擇與自己相同耳聾基因突變的聾啞人或攜帶者(如圖2所示與自己相同卡片的人)，這樣可避免大部分聾聾婚配家庭生育聾病后代，實現(xiàn)耳聾的二級預(yù)防。

4 結(jié)論

本研究通過對西安地區(qū)246例非綜合征性耳聾患者行遺傳性耳聾基因篩查及后續(xù)個性化分析，在以下方面彌補了目前臨床上存在的不足：①選取非綜合征性耳聾患者進行基因相關(guān)研究，很好的擴充了該部分人群的遺傳性耳聾基因研究數(shù)據(jù)。②針對西安地區(qū)，結(jié)合經(jīng)濟成本的考慮，非綜合征性耳聾患者應(yīng)以常見位點基因篩查為基礎(chǔ)，輔以深度測序技術(shù)的應(yīng)用，將在突變位點的診斷上有所提高。③臨床耳聾遺傳咨詢，應(yīng)結(jié)合基因檢測結(jié)果，以患者愿景為前提，在婚育、孕產(chǎn)、用藥等方面，制定個性化的遺傳咨詢策略，提出落地有效的實施方法，將三級預(yù)防方針滲透到遺傳咨詢的過程中。