陳民彪 蔡仁中 黃明芳 黃修明 廖緒強(qiáng)

(海南省人民醫(yī)院·海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院胸外科，海南 ?？?570311)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，以非小細(xì)胞肺癌(Non-samll cell lung cancer，NSCLC)發(fā)病率最高，占肺癌發(fā)病率的80%以上[1-3]。目前，NSCLC的臨床治療主要以手術(shù)切除、化療、放療為主，但預(yù)后不理想[4-6]。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性表達(dá)的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，能通過與靶基因相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其失調(diào)涉及癌細(xì)胞的各個(gè)方面，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、增殖、遷移和侵襲等過程[7-8]。蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)是近年被發(fā)現(xiàn)的包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥類型中眾所周知的腫瘤抑制因子，通過介導(dǎo)磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(Protein kinase B, AKT)信號(hào)通路的活化，與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)[9]。miR-16-5p在NSCLC中低表達(dá)，其被認(rèn)為是NSCLC的抑癌基因。因此，本研究旨在探討NSCLC中低表達(dá)的miR-16-5p對(duì)A549細(xì)胞活性、遷移和PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要材料 人源性NSCLC A549細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；TRIzol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；AS-miR-16-5p及miR-NC序列的設(shè)計(jì)合成委托上?？党缮锕こ逃邢薰?中國(guó))；含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司(美國(guó))；MTT試劑購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))；Transwell小室購(gòu)自Millipore公司(美國(guó))；PTEN抗體、p-AKT抗體PI3K抗體購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行傳代。取傳代后對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集A549細(xì)胞接種于6孔板中，分為Blank組、miR-NC組和AS-miR-16-5p組。根據(jù)LipofectamineTM2000說明書，在無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染miR-NC和AS-miR-16-5p質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染6 h后，培養(yǎng)基替換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收獲細(xì)胞用于qRT-PCR分析。

1.4 qRT-PCR檢測(cè) TRIzol試劑提取細(xì)胞mRNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，然后擴(kuò)增目的基因，檢測(cè)miR-16-5p表達(dá)水平。

1.5 MTT檢測(cè) 將每組A549細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)至24、48、72、96 h，然后小心棄掉上清液。每孔中加入20 μL MTT溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，然后小心棄掉上清液。每孔中加入150 μL DMSO溶液，避光震蕩10 min，通過酶標(biāo)儀測(cè)定A549細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度(OD值)。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將每組A549細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，使用無菌移液器在細(xì)胞上進(jìn)行垂直刮擦，然后將培養(yǎng)板用PBS洗滌2次，然后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后拍照。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 將每組A549細(xì)胞接種于24孔板中Transwell上室中，將500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基加入下室中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h。4%多聚甲醛固定后去除上室細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，通過酶標(biāo)儀測(cè)定A549細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度(OD值)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法 收集每組A549細(xì)胞并用PBS洗滌3次。RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞的總蛋白，并通過BCA法進(jìn)行蛋白定量。對(duì)總蛋白(25 μg蛋白/泳道)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。將膜與一抗在4℃孵育過夜，然后與二抗在室溫孵育1 h。使用ECL發(fā)光劑顯影并通過軟件進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)水平的影響 與Blank組、miR-NC組相比，AS-miR-16-5p組miR-16-5p表達(dá)水平下降(P<0.05)；Blank組與miR-NC組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；表明AS-miR-16-5p抑制miR-16-5p在NSCLC A549細(xì)胞的表達(dá)，見圖1。

圖1 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)水平的影響

2.2 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞活性的影響 與Blank組、miR-NC組比較，AS-miR-16-5p組細(xì)胞活性降低(P<0.05)；Blank組與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；表明AS-miR-16-5p顯著抑制NSCLC A549細(xì)胞的活性，見圖2。

圖2 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞活性的影響

2.3 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)處理24 h后，AS-miR-16-5p組較同期Blank組和miR-NC組細(xì)胞愈合率降低(P<0.05)，見圖3。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AS-miR-16-5p組較同期Blank組和miR-NC組細(xì)胞遷移能力降低(P<0.05)，表明AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞的遷移能力具有明顯的抑制作用，見圖4。

圖3 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞愈合率的影響

圖4 AS-miR-16-5p對(duì)NSCLC A549細(xì)胞遷移能力的影響(×200)

2.4 AS-miR-16-5p對(duì)PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響 與miR-NC組和Blank組相比，AS-miR-16-5p組PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；相反，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；表明AS-miR-16-5p調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)，見圖5。

圖5 AS-miR-16-5p對(duì)PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

NSCLC是一種常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年增加，占肺癌的總發(fā)病率80%左右[10-11]。miRNA是由19-24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，與靶標(biāo)mRNA的5′-URT或3′-UTR互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合以調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制翻譯和降解靶標(biāo)基因。目前發(fā)現(xiàn)的miRNAs達(dá)1000余種，在癌癥的疾病進(jìn)程中呈現(xiàn)高表達(dá)或低表達(dá)，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。miR-16-5p是miRNA-16家族中的一個(gè)亞型，現(xiàn)已明確miR-16-5p是一種抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力[12-14]。在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AS-miR-16-5p表達(dá)降低。靶向PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的AS-miR-16-5p通過調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和遷移對(duì)NSCLC具有抗癌作用，這可能為NSCLC的精確治療提供理論參考。

PTEN/PI3K/AKT通路參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生命活動(dòng)[15-18]。PTEN為人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，是NSCLC中已知的預(yù)后標(biāo)志物和腫瘤抑制因子，同時(shí)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性[19]。PTEN的低表達(dá)或者失活能夠增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路活化。PI3Ks家族包含在PI3K/AKT信號(hào)通路中，通過調(diào)節(jié)抗腫瘤藥物研究中的各種細(xì)胞過程，成為重要的腫瘤靶標(biāo)[20-21]。有研究證實(shí)，在許多腫瘤中減少或不存在的抑癌基因PTEN具有雙重特異性磷酸酶活性，其脂質(zhì)磷酸酶活性通過滅活PI3K/AKT信號(hào)通路來阻止生物過程，從而抑制腫瘤的發(fā)展[22]。也有文獻(xiàn)記載，PTEN的失活通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的侵襲能力，PTEN表達(dá)的上調(diào)可以抑制NSCLC細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明在NSCLC細(xì)胞中PTEN通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K / Akt通路來發(fā)揮其抑癌作用，而PI3K/Akt通路在生長(zhǎng)發(fā)育、增殖、凋亡、遷移、浸潤(rùn)過程中發(fā)揮重要作用[23-25]。miR-16-5p已經(jīng)被證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成[26-28]。隨后也被證實(shí)通過靶向PTEN靶標(biāo)來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和PI3K/AKT信號(hào)通路來促進(jìn)惡性黑色素瘤進(jìn)展。本研究通過轉(zhuǎn)染AS-miR-16-5p 48 h后A549細(xì)胞內(nèi)miR-16-5p表達(dá)下調(diào)，又分別通過MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，證實(shí)AS-miR-16-5p能明顯抑制A549細(xì)胞的活性和遷移。并且發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用AS-miR-16-5p抑制miR-16-5p后，PTEN蛋白表達(dá)增高，證明miR-16-5p調(diào)控PTEN表達(dá)，進(jìn)而影響其下游PI3K和AKT蛋白表達(dá)。

4 結(jié)論

AS-miR-16-5p能夠抑制NSCLC A549細(xì)胞活性和遷移。此外，AS-miR-16-5p通過負(fù)調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路有可能成為NSCLC新靶點(diǎn)之一。本研究為NSCLC的生物靶向治療提供了新的思路和依據(jù)。