王朝欽，宋昊玥，楊 熙，王艷瓊，龔 元

1.電子科技大學信息與通信工程學院，四川成都611731

2.電子科技大學光纖傳感與通信教育部重點實驗室，四川成都611731

流激光集成液體增益材料和光學微腔，常用作傳感器或片上光源。區(qū)別于傳統的固體激光器，微流激光集成了微流體系并采用流體狀的增益介質，具有激光閾值低、集成度高、波長可調、功能多樣等特點。相較于無源微腔和其他光流控檢測技術，激光微流控充分利用了增益介質的放大作用，增強了光和物質的相互作用，結合微腔實現激光出射。以激光信號作為輸出，具有以下優(yōu)勢：1）利用光學微腔和激光的放大作用，增強光和物質的相互作用，實現較高的靈敏度；2）激光具有方向性，相較于無方向性的熒光信號，其強度更強，具有較高的信噪比；3）激光線寬更窄，可實現更高的波長復用度，有利于實現高通量的生化傳感。

微流激光作為生化傳感領域的熱門技術，是微流技術與光學相結合的熱點方向和學科前沿[1-2]。在微腔結構方面，2003年，Helbo 等[3]利用兩塊平面反射鏡構成法布里-珀羅腔，實現了第一個片上微流激光器；Bhaktha 等[4]利用微流芯片通道壁上的隨機結構提供隨機反饋，實現了隨機微流激光。結合選擇性填充技術，Yu 等[5]基于反諧振光纖的微環(huán)諧振腔實現了激光輸出。Zhou 等[6]在硅基底上生長量子點實現了單縱模激光，利用光子晶體激光對環(huán)境溫度及表面電荷變化的敏感性，可實現折射率傳感。

在增益介質方面，基于有機染料，Moon 等[7]將裸光纖深入填充裝有羅丹明溶液的毛細管中，在泵浦脈沖的作用下觀察到了激光輸出；Kazes 等[8]將量子棒作為增益介質，以通信光纖作為諧振腔，利用光纖微腔的高Q 值克服了非輻射損耗，實現了微流激光輸出；Schafer 等[9]利用CdSe/ZnS 量子點形成10～40 μm 的液滴微腔，實現了單模和多模的激光發(fā)射；Gather 等[10]利用大腸桿菌內基因編碼的綠色熒光蛋白作為增益介質，實現了激光發(fā)射；Lee 等[11]將維生素B2 的水溶液作為增益介質，實現了生物相容的光微流激光。將激光粒子（laser particles, LPs）注入到細胞中并以泵浦激發(fā)，可實現細胞激光器[12-14]，通過收集其發(fā)射出的激光信號可以完成對LPs 的定位；Nicola 等[15]基于此原理完成了對腫瘤中數千個細胞的軌跡追蹤。

本文圍繞微流激光生化傳感技術的基本原理，分別介紹了基于增益介質調節(jié)、基于微腔調節(jié)和基于損耗調節(jié)的生化傳感。其中，基于增益介質調節(jié)的生化傳感是目前主流的微流激光生化傳感原理，應用范圍最廣，也是本文重點討論的內容。例如，當待測物直接或間接影響增益分子的數量或狀態(tài)，將會導致激光輸出特性變化。通過標定激光輸出特性與待測物濃度之間的關系，則可對待測物含量進行傳感測量?；谖⑶蛔兓纳瘋鞲幸彩潜疚挠懻搩热葜唬郎y物引起微腔尺寸或形狀的變化，從而引起激光輸出特性的變化，如激光波長。最后，闡述了基于損耗調節(jié)的生化傳感。待測物調節(jié)腔內的吸收損耗或散射損耗，使得激光輸出強度發(fā)生變化。

1 基于增益介質調節(jié)的微流激光生化傳感技術

微流激光器由諧振腔、增益介質和泵浦構成。泵浦為系統提供能量、激活增益介質、實現粒子數反轉，進而實現光放大。諧振腔可以增強光和物質的相互作用，因此基于微流激光的傳感器能靈敏地反映激光腔內待測物分子的數量和狀態(tài)的變化。通過生化反應，使待測物分子的數量能夠直接或間接影地響增益介質的數量或狀態(tài)，是微流激光傳感領域中最常用的一種方式。

1.1 基于增益分子數量變化實現生化傳感

在生化傳感應用中，常利用生物化學的方法使增益分子與待測物之間建立直接或間接的一一對應關系。待測物的數量可以決定在光學微腔中總的增益分子的數量。增益分子的數量又決定了激光輸出特性，則通過對微流激光器的輸出可實現待測物濃度的傳感。

免疫檢測“金標準”酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是將一定濃度的抗原或抗體固定于固相載體表面，加入待檢樣本后通過酶標物顯色的深淺間接反映被檢抗原或抗體的存在與否或量的多少，如圖1(a) 所示。Wu 等[16]提出了微流激光ELISA，通過將傳統的雙抗體夾心ELISA 方法與光學微腔結合，先將捕獲抗體交聯于方形毛細管內表面，再把待測物通入毛細管孵育，使其與固定在方形毛細管上的捕獲抗體相交聯，如圖1(b) 所示。用清洗液除去未結合的分子，再讓特異性識別待測物的檢測抗體通入毛細管內孵育，使固定在捕獲抗體上的待測物分子與檢測抗體特異性結合。用清洗液清洗后，讓鏈霉親和素標記的過氧化氫酶（SAv-HRP）溶液流過方形毛細管并孵育，使SAv-HRP 分子與檢測抗體相交聯。由于抗體與抗原交聯的特異性，只有成功捕獲到待測物的抗體位點才能存在檢測抗體，并與SAv-HRP 分子特異性結合。與待測物分子結合的抗體位點越多，捕獲到的SAv-HRP 分子數量也就越多。完成了對方形毛細管的處理后，將無色透明的底物溶液通入毛細管內并用泵浦激發(fā)。待測分子數量的多少決定了固定在光學微腔表面的HRP 數量，HRP酶的數量又決定了催化底物產生熒光產物的效率，具體表現為激光出射時間的長短，如圖1(c)所示。因此，通過測量激光出射時間，就能夠完成對待測物的傳感。

圖1 微流激光ELISAFigure 1 Optpfluidic laser-based ELISA

基于同樣的表面固定原理，Mao 等[17]探索了表面位點對檢測性能的影響，實現了基于光纖微流激光的HRP 檢測。以一次性空心光纖（hollow optical fiber, HOF）作為光學微腔，研究了納米粒子對傳感靈敏度的提升作用。將HOFs 生物素化處理后分為3 組，包括對照組、Au 納米棒和SiO2納米顆粒組，如圖2(a)所示。其中，Au 納米棒和SiO2納米顆粒組的表面更豐富，可提供更多的SAv-HRP 結合位點，這也導致了HOFs 的表面體積比發(fā)生變化。再用緩沖液稀釋成不同濃度的HRP 通入3 組具有不同表面體積比的HOFs 內孵育，SAv-HPR分子與表面位點特異性結合形成亞單分子層覆蓋在HOFs 的內表面。向處理好的HOFs 內通入無色底物溶液，HPR 酶會與無色底物溶液發(fā)生反應產生增益介質。在相同催化時間下，增益介質的濃度取決于光纖表面固定的SAv-HPR 分子數量，因此在一定的實驗裝置以及光學微腔下，孵育固定的SAv-HRP 分子數目決定激光的輸出。研究表明，SAv-HRP 分子的濃度與30 min 時激光的積分強度之間有較好的線性關系。如圖2(b) 所示，納米粒子對傳感靈敏度的提升作用顯著。當Au 納米棒存在時，傳感靈敏度提升了23.3%；在SiO2納米棒存在時，傳感靈敏度提升了57.4%。為排除通過非特異性吸附到光纖內壁的SAv-HRP 分子對實驗的影響，該工作設置了空白組，無激光激發(fā)，實驗結果證明通過非特異性吸附到光學微腔內表面的分子數量是可以忽略的。

圖2 基于空心光纖的HRP 檢測Figure 2 HRP detection based on hollow fiber

待測物除了結合在光學微腔表面外，還可以在體溶液中進行檢測。例如，Gong 等[18]提出酶催化微流激光，實現了高性能的離子傳感。酶催化微流激光的實驗裝置如圖3(a) 所示，用兩塊高反鏡平行放置構成法珀腔，位于兩塊高反鏡之間的方形石英毛細管作為微流通道實現液體流入和流出。在酶催化微流激光傳感器中，采用HRP 催化無熒光透明底物生成的熒光產物作為微流激光器的增益介質。硫離子會抑制HRP 的活性，從而間接地影響激光發(fā)射進程，反應體系中硫離子的濃度越高，則酶的活性越低，熒光產物濃度增加速率放緩，使激光出射時間延長，如圖3(b) 和3(c) 所示，激光出射時間與反應體系中硫離子的濃度相關，則通過測量激光出射時間，可實現硫離子的濃度傳感。最終實現了探測下限為10 nM，動態(tài)范圍為3個量級的硫離子濃度傳感，如圖3(d) 所示。

圖3 酶催化微流激光用于硫離子傳感。(a) 微流激光離子傳感器裝置示意圖；(b) 酶催化微流激光傳感原理示意圖；(c) 激光輸出強度與時間的關系曲線；(d) 硫離子標定曲線Figure 3 Enzyme catalyzed optofluidic laser for sulfur ion sensing.(a) Schematic diagram of optofluidic laser ion sensor device;(b)schematic diagram of enzyme catalyzed optofluidic laser sensing principle; (c) relation curve between laser output intensity and time; (d)calibration curve of sulfur ion

1.2 基于增益分子狀態(tài)變化實現生化傳感

在熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）傳感原理中，當一個熒光分子（又稱為供體分子）的發(fā)射峰與另一個熒光分子（又稱為受體分子）的吸收峰重疊時，供體分子可將能量轉移給受體分子使供體分子光強減弱，受體分子發(fā)光。傳統的FRET轉換效率受分子間距離調控，工作距離僅在10 nm 以內。在微流激光中，將供體-受體對置于光學微腔內，并以此實現激光發(fā)射。將供體和受體分別交聯于蛋白質等大分子的兩端。當生物大分子發(fā)生形態(tài)變化時，供體和受體之間的距離會發(fā)生變化，能量轉移效率改變，影響輸出光的波長成分。通過分析輸出光的光譜，便可通過供受體之間的波長轉換效率來反映蛋白質的形態(tài)變化。Fan 團隊[19]在Holliday 結構DNA 的4 個臂上分別交聯青色素染料Cy3 和Cy5分子作為供體/受體對，當鎂離子濃度增加時，Holliday 結構DNA 逐漸折疊，轉化為堆疊的X 型結構，如圖4(a) 所示。Cy3 和Cy5 分子間的距離減小，能量轉換效率變大。波長逐漸從Cy3 發(fā)射峰轉移至Cy5 發(fā)射峰。通過檢測Cy3 和Cy5 的輸出波長轉換比例，可精確地反映樣本中鎂離子的濃度，如圖4(b) 所示。此外，利用波長轉換的特性，該團隊還制作出可完全由生物方法調節(jié)輸出波長的激光器，通過調節(jié)鎂/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液的比例，使得激光器的輸出在兩種波長之間切換，且輸出波長切換是可逆并可重復進行的。

圖4 Holliday 結構DNA 用于鎂離子檢測Figure 4 Holliday structure DNA for magnesium ion detection

通過控制增益分子的激發(fā)/淬滅狀態(tài)，也可以實現待測物的傳感。Wu 等[20]利用該原理，基于具有donor-acceptor-donor 結構的富電子染料實現了用于爆炸物檢測的微流激光傳感器，完成了對二硝基甲苯（DNT）的傳感。DNT 在化學上是缺電子炸藥，與富電子熒光染料相互作用時會產生熒光淬滅效應。將方形毛細管夾在2 個反射率分別為91.5%（上）和99.5%（下）的反射鏡之間，高反鏡提供光反饋，毛細管作為微流通道，如圖5(a) 所示。將富電子熒光染料與DNT 溶液混合后注入光學微腔，由于DNT 對熒光染料的淬滅作用，能正常參與激光發(fā)射的熒光染料分子數與DNT 的濃度呈負相關，進而根據其激光積分強度來確定DNT 的濃度。如圖5(b) 所示，該工作實現了檢測下限10 nM，動態(tài)范圍超3 個量級的高性能傳感。

圖5 基于激光淬滅的爆炸物傳感Figure 5 Explosive sensing based on laser quenching

類似地，微流激光也可以與DNA 熔解曲線分析技術相結合，通過控制染料分子與DNA雙鏈結合與釋放這兩種狀態(tài)，可以完成對DNA 堿基失配數量的判斷。如圖6(a) 所示，當染料分子與雙鏈DNA（dsDNA）結合時具有較強的熒光。隨著溫度的升高，雙鏈DNA 解離成單鏈DNA（ssDNA）。染料從雙鏈DNA 鏈中釋放出來，其熒光減弱。在DNA 熔解曲線分析中通過檢測熒光強度作為溫度的函數，得到DNA 熔解曲線，該曲線取決于兩條結合DNA 鏈之間的親和力，親和力又取決于DNA 的長度和序列，以及堿基錯配的數量。通過對比熔解曲線，就可以判斷出堿基失配的數量。Lee 等[21]利用激光腔提供的光反饋來放大熱動力學差異，將DNA 樣本和飽和染料放置在微流激光器微腔中進行腔內檢測，如圖6(b) 所示。用激光代替熒光作為傳感信號，實現了單堿基失配DNA 的區(qū)分，如圖6(c) 和6(d) 所示。

圖6 基于微流激光的DNA 熔解曲線分析技術。(a) DNA熔解曲線分析原理圖；(b) 實驗裝置示意圖；(c) 溫度與激光閾值的關系；(d) 溫度與輸出激光強度的關系Figure 6 DNA melting curve analysis technology based on optofluidic laser.(a)DNA melting curve analysis schematic diagram; (b) schematic diagram of experimental device; (c) relationship between temperature and laser threshold; (d)relationship between temperature and output laser intensity

2 基于微腔調節(jié)的微流激光生化傳感技術

在微流激光生化傳感中，可以通過對微腔進行調節(jié)實現傳感。目前基于微腔調節(jié)的微流激光生化傳感技術主要分為兩種：一種是調節(jié)諧振腔的尺寸，另一種是調節(jié)諧振腔的結構。諧振腔的改變會引起諧振頻率或波長改變，標定其與被測物濃度之間的對應關系，可實現對被測物濃度的定量檢測。

2.1 基于諧振腔尺寸變化實現傳感

在基于諧振腔尺寸變化實現生化傳感中，可以通過機械手段對諧振腔進行拉伸，改變諧振腔的大小，實現激光波長的調節(jié)，構建可調諧微流激光器。Tang 等[22]利用高Q 值的微泡腔，成功構建了閾值為7.8 μJ/cm2、線寬約為0.1 nm 的微流激光器，如圖7(a) 所示。用共軛聚合物（CN-PPV）作為增益材料，通過橫向拉伸諧振腔，實現對諧振頻率的微調，構建可調諧微流激光器。

圖7 通過諧振腔尺寸變化實現傳感Figure 7 Sensing by changing the size of the resonator

微流激光器具有利用機械拉伸實現激光頻率調諧的潛力。機械拉伸可改變空心氣泡諧振腔的尺寸，通過對回音壁模式（WGM）微腔的幾何邊界條件改變與應變誘導折射率改變，實現對諧振波長的微調。將諧振腔的一端用UV 膠固定，另一端用儀器對其進行拉伸。研究發(fā)現，微流激光器的波長隨著毛細管的拉伸發(fā)生漂移，如圖7(b) 所示。當拉伸長度超過54 μm時，激光波長可超出自由光譜范圍。盡管拉伸長度較長，但輸出的激光強度穩(wěn)定且持久。共軛聚合物因其優(yōu)異的光穩(wěn)定性、較大的消光系數和較低的細胞毒性，在生物分析與成像方面引起了廣泛關注。與典型的染料激光器相比，微泡腔中共軛聚合物填充的微流激光器具有更好的光穩(wěn)定性，可增加生化分析的可靠性與靈敏度，為微流激光器在生物傳感和醫(yī)學診斷領域的進一步發(fā)展提供了可能。

2.2 基于諧振腔結構變化實現生化傳感

在基于諧振腔結構變化實現生化傳感中，可以通過改變分子取向實現生化傳感[23]。Li等[24]提出了一種基于WGM 的新型液晶微光纖生物傳感器，通過改變液晶分子取向，引起微腔結構變化，激光波長發(fā)生漂移。通過波長的漂移量可以表征脂肪酶濃度。

液晶光纖的基底材料為聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），表面為一層4-氰基-4′-戊基聯苯（5CB）分子。微光纖表面的甘油三油酸酯在脂肪酶的催化下生成油酸。一般情況下，因為甘油三油酸酯的疏水性不能在液晶表面自發(fā)形成一層單分子層，使液晶分子處于平面排列狀態(tài)，如圖8(a) 與8(b) 所示。當脂肪酶存在于溶液中時，生成油酸，使得液晶分子取向由平面排列變?yōu)榇怪迸帕?，如圖8(c) 所示。由于液晶分子的各向異性，當液晶分子取向改變時，介電常數會發(fā)生改變，使諧振波長發(fā)生漂移。因此，通過波長的漂移量可表征脂肪酶濃度，檢測下限為0.01 μg/mL，如圖10(d) 所示。基于WGM 的液晶微光纖微流激光可以靈敏地響應微腔結構的變化，將波長漂移量作為傳感參量，實現對脂肪酶濃度的檢測。

圖8 脂肪酶與甘油三油酸酯發(fā)生酶促反應前后液晶光纖中5CB 分子取向示意圖。(a)～(b) 平面取向；(c) 垂直取向；(d) 波長漂移量與脂肪酶濃度變化的關系Figure 8 Orientation of 5CB molecule in liquid crystal optical fiber before and after the enzymatic reaction between lipase and triglyceride.(a)～(b) Plane orientation; (c) vertical orientation; (d) relationship between wavelength shift and lipase concentration

3 基于損耗調節(jié)的微流激光生化傳感技術

在微流激光生化傳感的應用中，除了檢測增益介質、微腔的變化之外，也可以通過微腔內不同的損耗實現傳感。與待測物相關聯的物質對激光產生吸收或散射效應，會使激光強度下降，從而實現待測物的傳感。目前基于損耗調節(jié)的微流激光傳感技術主要分為兩種：一是基于散射損耗傳感，二是基于吸收損耗傳感。激光腔增強了光和物質的相互作用，可放大吸收損耗和散射損耗，進而提升傳感的靈敏度。

3.1 基于散射損耗實現生化傳感

在傳統的免疫比濁法中，抗體與其抗原混合形成抗原抗體復合物（AACs）。在促聚劑的作用下從液相析出，形成懸浮于液相中的微顆粒，溶液會出現一定的濁度，對光有吸收、散射和反射作用，使光強減弱。Yang 等[25]將微流激光技術與免疫比濁法結合，提出微流激光免疫比濁法，如圖9(a) 所示。在抗體過量的情況下，抗原濃度不同，形成的AACs 的尺寸和濃度也隨之發(fā)生變化，產生的損耗也不同，則可通過檢測光強來表征抗原濃度（如圖9(b) 所示）。利用光學微腔和激光增強了光與物質的相互作用，實現了高靈敏的蛋白質傳感。以激光強度作為傳感參量，實現了5 個數量級的動態(tài)范圍，以及0.18 pg/mL 的極低檢測下限。與傳統單次透射法和腔增強熒光法相比，微流激光免疫比濁法得益于微腔和激光的放大作用，具有較高的檢測靈敏度。

圖9 微流激光免疫比濁法Figure 9 Optofluidic laser immunoturbidimetry

此外，Yang 等[25]在研究一次性微流激光傳感器時，也采取了散射損耗調節(jié)的方案。將IgG 標準溶液與Tris-PEG 緩沖液混合并孵育，記為A 溶液。再將抗體溶液加入A 溶液中，孵育并靜置，獲得免疫復合物懸浮液，記為B 溶液，最后將RhB 溶液與B 溶液按1∶9 的體積比混合，吸入HOF，立即記錄激光輸出?？乖涂贵w特異性結合，并在PEG 的輔助下形成不溶于水的免疫復合物，如圖10(a) 所示。隨著反應時間的延長，免疫復合物的大小和濃度都會增加。當免疫復合物的尺寸達激光波長的1/30～1/6 時，根據瑞利散射理論和Beer-Lambert定律，HOF 內的免疫復合物引起吸收、散射和反射損耗以衰減激光輸出，以激光強度作為傳感輸出，可以在10 min 內完成蛋白質檢測，如圖10(b) 所示。

圖10 基于微流激光的一次性免疫傳感Figure 10 Disposable immunosensor based on optofluidic laser

3.2 基于吸收損耗實現生化傳感

通過吸收損耗調節(jié)激光輸出特性實現傳感，也是實現微流激光生化傳感的一個途徑。不同濃度的待測物對激光的吸收能力不同，對比激光通過待測物前后的強度就可以完成對待測物的傳感。為產生較強的吸收損耗，通常將激光波長優(yōu)化至待測物的吸收帶?；诖?，Gong等[26]實現了分布式光纖微流激光器，用于高通量生化傳感。利用沿光纖軸向連續(xù)分布的微環(huán)諧振腔作為一維光源，在其上方集成5 根方形石英毛細管作為樣品通道，如圖11(a) 所示。光纖出射的激光可以被毛細管內部的反應物吸收，導致透過毛細管后攝像機接受到的激光強度下降。通過計算分布式光纖微流激光器輸出信號的透射率變化，就可以實時監(jiān)測每個通道的反應過程[20]。根據重吸收效應，通過調節(jié)下方光纖激光器增益介質的濃度可以實現輸出波長調節(jié)，使其與上方方形石英毛細管中產物的吸收峰相對應。在方形石英管中，放置HRP 酶和無色底物TMB 的混合物，二者混合后會逐漸變成藍色，其吸收強度會隨著反應的進行而增大，根據Beer-Lambert 定律，傳感通道的透射率減小。以透射率降低到初始值的90%的時間作為傳感信號。圖11(b) 為不同HRP 濃度下，歸一化光透過率隨反應時間變化的關系曲線。結果表明，該方法通過調節(jié)吸收損耗，成功實現了14 pM 的檢測下限，并實現了陣列化的酶濃度傳感。

圖11 分布式光纖微流激光用于高通量傳感Figure 11 Distributed fiber microfluidic laser for high throughput sensing

4 結 語

本文綜述了微流激光生化傳感的主要機理，并從增益分子、微腔、損耗3 個角度闡釋了微流激光的傳感原理。利用增益分子的數目和狀態(tài)變化，微腔的尺寸與形狀變化，激光的散射與吸收損耗等都可以完成高靈敏度的生化傳感。微流激光傳感相對于傳統的熒光傳感而言，在信號產生原理和輸出特性上有著本質的不同，這使得微流激光在靈敏度、光譜復用度、成像空間分辨率和生物相容性等方面有著獨特的優(yōu)勢。微流激光技術與最新的生化檢測技術相結合，有望開拓出更多新的應用領域。