李峻雅，孫增輝，韓亮，邱淑妍

(惠州市第三人民醫(yī)院，廣東 惠州 516000)

0 引言

當(dāng)前臨床隨著抗生藥物濫用與創(chuàng)傷性診療技術(shù)的廣泛開展，多種感染性疾病發(fā)病率逐年上升，明確病原菌，是選擇合適抗菌藥物治療感染性疾病的關(guān)鍵[1]。血培養(yǎng)為病原菌檢查的金標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的診斷價(jià)值，但耗時(shí)較長(zhǎng)，從陽性警示到最終的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少需要48h，這對(duì)于感染病情較重的患者而言，臨床應(yīng)用價(jià)值較低[2]。因此，尋求方便快捷且準(zhǔn)確度高的新型病原菌鑒定技術(shù)為感染性疾病患者的治療研究重點(diǎn)[3]。MALDI-TOF-MS為近年來的新興軟電離生物質(zhì)譜，其基本工作原理為利用激光為能量來源，將待測(cè)細(xì)菌表面成分解析為離子，經(jīng)過飛行時(shí)間檢測(cè)器的時(shí)間長(zhǎng)短將不同質(zhì)荷比(m/z)的離子分離，以此形成不同高度的波譜峰質(zhì)譜圖[4]。再利用標(biāo)準(zhǔn)的菌株分型系統(tǒng)，可有效向其進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定，具有較高的準(zhǔn)確率、特異性和靈敏度，因此在臨床中已得到廣泛應(yīng)用[6]。若在其基礎(chǔ)上聯(lián)合分離膠法檢測(cè)，通過利用分離膠法的血清穩(wěn)定優(yōu)勢(shì)，可加快分離血液中紅細(xì)胞和血清，降低誤差，可進(jìn)一步縮短細(xì)菌鑒定時(shí)間，提高準(zhǔn)確率并且降低醫(yī)療成本。但當(dāng)前臨床對(duì)于兩者聯(lián)合應(yīng)用的準(zhǔn)確度研究較少，基于此，本文就對(duì)MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)血培養(yǎng)陽性標(biāo)本對(duì)病原菌的鑒定作用展開研究，具體如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

以我院2020年10月至2021年2月內(nèi)收治的211例感染性疾病患者的陽性血清樣本為本次研究標(biāo)本，所選研究對(duì)象中男女分別占比54.50%(115/211)、45.50%(96/211)；年齡段為18～90歲，平均67.43±5.11歲；經(jīng)血培養(yǎng)檢出，革蘭陽性菌共91例、革蘭陰性菌87例、真菌33例。

1.2 方法

所選血清標(biāo)本均行MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)，具體檢測(cè)方法為：血清標(biāo)本均轉(zhuǎn)移至INSEPACK@ST740CG型真空采血管中，混勻后實(shí)施常規(guī)離心處理，去上層清液，以經(jīng)高壓處理后的無菌棉簽挑取分離膠表面菌體富集物，加入75%1mL乙醇溶液重懸，混勻后以20817×g離心2min，取沉淀物，點(diǎn)樣沉淀1μL至96孔金屬靶板，室溫干燥后，96孔金屬靶板點(diǎn)樣甲酸水溶液1μL以裂解細(xì)菌菌體，待干燥后點(diǎn)樣乙腈μL用以萃取菌體蛋白，進(jìn)樣至MALDI-TOF-MS系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)菌菌種分析。實(shí)驗(yàn)過程按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》嚴(yán)格執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)過程按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》嚴(yán)格執(zhí)行。

細(xì)菌分離及傳統(tǒng)鑒定：細(xì)菌的分離提純標(biāo)本分別接種于血瓊脂、麥康凱平板培養(yǎng)基中，置于含有5%CO2的35℃孵箱中孵育24 h后，挑取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落制備成細(xì)菌懸液上機(jī)鑒定。細(xì)菌鑒定使用梅里埃提供的VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀及配套鑒定和藥敏卡。所有菌株的分離培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

所選血清樣本進(jìn)行MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的梅里埃VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，若有不符，以16SrRNA序列分析結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，百分比(%)表示計(jì)數(shù)資料。

2 結(jié)果

2.1 革蘭陽性菌快速鑒定法符合率分析

MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)的革蘭陽性菌符合率為78.02%(71/91)，詳情見表1。

表1 革蘭陽性菌快速鑒定法符合率分析 [n(%)]

2.2 革蘭陰性菌快速鑒定法符合率分析

MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)的革蘭陰性菌符合率為85.06%(74/87)，詳情見表2。

表2 革蘭陰性菌快速鑒定法符合率分析[n(%)]

2.3 真菌快速鑒定法符合率分析

MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)的真菌符合率為24.24%(8/33)，詳情見表3。

表3 真菌符合率分析[n(%)]

3 討論

感染性疾病種類很多，一般由病原微生物引起的機(jī)體疾病統(tǒng)稱為感染性疾病，細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、蠕蟲、支原體、衣原體等均病原微生物侵襲機(jī)體后，均可歸為感染性疾病，其中細(xì)菌及真菌最為常見。當(dāng)前，隨著我國正式邁入老齡化社會(huì)，老年人群基數(shù)的增加，導(dǎo)致以老年人為高發(fā)群體的多種疾病發(fā)病率居高不下，而老年人受身體機(jī)能退化影響，對(duì)上述致病菌的抵抗力較弱，在受原發(fā)性疾病因素影響下，感染風(fēng)險(xiǎn)也隨之上升。而明確致病菌種屬，是正確使用抗菌藥物的關(guān)鍵[6]。

MALDI-TOF-MS是有基質(zhì)輔助激光解析離子源(MALDI)與飛行時(shí)間質(zhì)量檢測(cè)器(TOF)兩部分組成，其中MALDI是利用一定強(qiáng)度的激光照射血清標(biāo)本與基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，當(dāng)基質(zhì)從激光吸取能量后，可逐漸汽化降解，使標(biāo)本分解吸附，產(chǎn)生電離反應(yīng)[7]。在此基礎(chǔ)上，TOF通過記錄帶有電荷的標(biāo)本分子在電場(chǎng)作用下的飛行時(shí)間以此形成質(zhì)量圖譜，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌種屬圖譜系統(tǒng)明確受檢細(xì)菌種屬，以此實(shí)現(xiàn)致病菌的區(qū)分與鑒定[8]。但單一使用是對(duì)于血清的標(biāo)本取樣耗時(shí)較長(zhǎng)，因此，此技術(shù)在臨床應(yīng)用時(shí)，多聯(lián)合分離膠法共同檢測(cè)。其促凝優(yōu)勢(shì)，可快速分離血清與沉淀物，縮短檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，取得明確診斷價(jià)值[9]。且此方式的成本較低，實(shí)用性強(qiáng)，患者接受度較高，安全性能也較高，無過多轉(zhuǎn)移、洗滌工序，對(duì)標(biāo)本的污染風(fēng)險(xiǎn)較低[10]。而本研究結(jié)果也顯示，通過將兩者聯(lián)合用于感染性疾病患者的病原菌鑒別中，對(duì)于革蘭陰性菌符合率最高，陽性率次之，真菌符合率最低。提示，MALDI-TOF-MS對(duì)于革蘭陰性菌的檢出率更高，分析原因，可能與革蘭陰性菌細(xì)胞壁的肽聚糖較薄且沒有磷壁酸，但具有外膜等特點(diǎn)有關(guān)，這正好符合MALDI-TOF-MS的結(jié)晶薄膜作用機(jī)制，可有效提高其激光能量吸附作用，促使其快速產(chǎn)生電離反應(yīng)和形成質(zhì)量圖譜，進(jìn)而起到細(xì)菌種屬鑒別作用[11-12]。由此可見，MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)對(duì)于革蘭陰性菌的鑒別應(yīng)用價(jià)值更高，可此進(jìn)行深入研究。

綜上所述，以MALDI-TOF-MS聯(lián)合分離膠法檢測(cè)血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，可取得較高的病原菌檢出準(zhǔn)確率，其方便快捷，可為患者的早期治療提供可靠參考。