邱麗湞，吳共發(fā)，劉鈺君，曾宇婷，賴劍龍，李海剛

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院健康管理中心，廣東廣州 511300；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科，廣東廣州511300；3.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院病理科，廣東廣州 510120

該課題組前期研究顯示，miR-200a 在結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）中表達(dá)下調(diào)[1]，具有高度轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞表達(dá)最低，成瘤但不轉(zhuǎn)移的細(xì)胞表達(dá)最高[2]，在CRC 細(xì)胞中下調(diào)miR-200a 能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡[3]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1 （metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）已經(jīng)被認(rèn)為可以作為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等的標(biāo)志物。 前期研究證實(shí)，CRC 患者癌組織中高表達(dá)MACCl，MACCl 的高表達(dá)與CRC 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和高級(jí)別臨床分期密切相關(guān)[4-5]。目前，miR-200a 與MACC1 的關(guān)系未闡明， 該研究是在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討miR-200a 對(duì)CRC 細(xì)胞的作用及潛在機(jī)制。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo 購自中科院上海生命科學(xué)研究院。 miR-200a 的類似物mimics 及其陰性對(duì)照物negative control（NC）由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，序列為：mimicssense：5’-UAACACUGUCUG GUAACGAUGU-3’、anti-sense：5’-AUCGUUACCAGACAGU GUUAUU -3’；NCsense：5’ -UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3’、anti-sense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM 和陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司；兔多克隆濃縮型抗體MACC1（產(chǎn)品編號(hào)ab226803）購自英國abcam 公司；β-actin 抗體（sc-69879） 購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；過氧辣根酶標(biāo)記抗兔IgG 購自中杉金橋；PVDF 膜購自美國Millipore 公司； 抗體稀釋液購自福州邁新公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、蛋白抽提試劑盒 （P0028）、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（P0012）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（P0012AC）、ECL 反應(yīng)檢測(cè)試劑盒（P0018S）均購自碧云天生物技術(shù)；Transwell板和各類培養(yǎng)板等購自美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 LOVO 細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI-1640， 培養(yǎng)環(huán)境37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且無污染的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分為3組，mimics 組（轉(zhuǎn)染miR-200a mimics）、blank 組（轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體） 和NC 組 （轉(zhuǎn)染miR-200a negative control）。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)按照該實(shí)驗(yàn)組前期方法進(jìn)行[1]。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 制作細(xì)胞懸液并計(jì)算細(xì)胞濃度，96 孔板的每個(gè)孔的細(xì)胞量為0.5×104，每孔的終體積100 μl/孔，mimics 組、blank 組和NC 組的每組均設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔， 各組轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)，每孔加CCK-8 液10 μl，加樣后的96 孔板避光，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，選擇450 nm 波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光光度值（OD 值），計(jì)算平均值。

1.2.3 同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) mimics 組、blank 組和NC 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，制作1×105個(gè)/mL 濃度的細(xì)胞懸液， 預(yù)鋪各組細(xì)胞的96 孔板中相對(duì)應(yīng)地加入100 μl 懸液， 放置在37℃、50 mL/L CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，輕晃培養(yǎng)板后將所有液體吸到另外一塊新96 孔板，PBS 輕洗2 次并將液體完全吸到新96 孔板。 將新96 孔板置于培養(yǎng)箱孵育30 min，待細(xì)胞沉淀在板底后于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)未黏附細(xì)胞數(shù)。同質(zhì)性細(xì)胞黏附數(shù)=1×104-未黏附細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Matrigel 基質(zhì)膠鋪24 孔板上室， 接種2×104/mL 個(gè)/每孔的各組細(xì)胞懸液于上室，下室加入500 μl RPMI-1640。 把24 孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 h，PBS 洗去死亡懸浮細(xì)胞，將膜用甲醇浸泡固定20 min，浸泡在蘇木素中染色5 min，PBS 清洗后用棉簽擦去膜的內(nèi)室面未穿膜的細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)顯微鏡下5 個(gè)高倍視野的下室面膜細(xì)胞穿過數(shù)， 取平均值。

1.2.5 Western Blot mimics 組、blank 組和NC 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后離心收集， 保存在-80℃冰箱備用。進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)時(shí)，-80℃冰箱中取出樣本，按試劑盒說明書進(jìn)行蛋白提取并測(cè)定濃度，每個(gè)電泳孔的上樣量均為40 μg， 使用SDS-PAGE 凝膠電泳法，蛋白轉(zhuǎn)膜使用濕轉(zhuǎn)法， 室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST 緩沖液封閉印跡膜1 h，加入MACC1 一抗（稀釋度為1:1 000），4℃過夜孵育， 封口膜封蓋防止干燥，次日上午洗膜，按1:5 000 稀釋過氧辣根酶標(biāo)記抗兔IgG 配制成工作液使用，室溫條件下孵膜1 h，蛋白條帶顯影用ECL 化學(xué)發(fā)光法， 內(nèi)對(duì)照為β-actin 蛋白。 使用Image J 軟件對(duì)Western Blot 條帶進(jìn)行灰度值量化分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=灰度值目的蛋白/灰度值β-actin。

1.2.6 在線基因庫數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè) 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)預(yù)測(cè)miR-200a 和MACC1 的靶向關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；影響因素采用單向方差分析，組間比較根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇多重比較方法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組細(xì)胞增殖能力變化比較

CCK-8 法結(jié)果顯示mimics 組的OD 值為（1.27±0.07），均顯著低于blank 組的（1.75±0.04）和NC 組的（1.70±0.08）， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=27.780，P<0.001），blank 組和NC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.599）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示mimics 組細(xì)胞增殖能力顯著減低。 見圖1。

圖1 過表達(dá)miR-200a 對(duì)LOVO 細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 3 組同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞黏附力變化比較

mimics 組、blank 組和NC 組細(xì)胞的同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞黏附數(shù)量分別為 （1 241.33±76.42）、（1 021.00±62.00）和（994.67±53.78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.130，P=0.006）， 兩兩比較顯示，mimics 組細(xì)胞黏附能力顯著高于blank 組和NC 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.006、0.003）。 blank 組和NC 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.636）。 見圖2。

圖2 過表達(dá)miR-200a 對(duì)LOVO 細(xì)胞同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞黏附力的影響

2.3 3 組細(xì)胞侵襲能力變化比較

mimics 組、blank 組和NC 組細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)分別為 （54.20±6.83）、（85.6±6.39） 和 （88.00±5.52），3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=13.130，P=0.006）， 兩兩比較顯示，mimics 組細(xì)胞侵襲穿膜數(shù)顯著低于blank 組和NC 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.001），blank 組和NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.890）。 見圖3。

圖3 過表達(dá)miR-200a 對(duì)LOVO 細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4 3 組細(xì)胞MACC1 的表達(dá)變化比較

Western Blot 條帶使用Image J 軟件讀取灰度值，計(jì)算各組蛋白相對(duì)表達(dá)量，mimics 組、blank 組和NC組的MACCI 蛋白表達(dá)灰度值分別是（0.011±0.003）、（0.284±0.043）和（0.293±0.071），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.084，P=0.001）。 兩兩比較顯示，mimics 組的MACC1 表達(dá)量顯著低于blank 組和NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），blank 組和NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.820）。

2.5 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

在線數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-200a 與MACC1 存在一定的互補(bǔ)堿基對(duì)，MACC1 是miR-200a 的潛在靶向基因。 見圖4。

圖4 miR-200a 和MACC1 互補(bǔ)的核苷酸序列

3 討論

CRC 在世界范圍內(nèi)癌癥的病死率中居第二位，雖然近年對(duì)CRC 這種疾病治療干預(yù)方面已經(jīng)取得新進(jìn)展，但CRC 患者的病死率仍然很高。轉(zhuǎn)移的形成是導(dǎo)致CRC 患者最終死亡的主要原因[6]，因此提高CRC患者存活率，尋找能評(píng)估轉(zhuǎn)移形成的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的生物標(biāo)志物， 識(shí)別疾病驅(qū)動(dòng)因素的分子機(jī)制有助于為CRC 尋找新的治療干預(yù)點(diǎn)。

大量研究報(bào)道顯示，miRNAs 在生理過程如新陳代謝、細(xì)胞凋亡、分化和病理過程如腫瘤細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期、 細(xì)胞凋亡、 侵襲乃至轉(zhuǎn)移過程中極具效果，miRNAs 表達(dá)失調(diào)對(duì)惡性腫瘤（包括結(jié)直腸癌）的生長(zhǎng)、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移具有重要關(guān)系[7-8]。 miR-200a 作為miR-200 家族成員之一，在CRC 中的表達(dá)失調(diào)及對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-200a 在CRC 中的作用類似抑癌基因的作用,其表達(dá)下調(diào)甚至缺失能促進(jìn)CRC 的惡性進(jìn)展[9-11]。 該研究基于前期研究開展進(jìn)一步探討實(shí)驗(yàn)， 研究結(jié)果顯示，在CRC 細(xì)胞中過表達(dá)miR-200a 能抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力，增強(qiáng)同質(zhì)性細(xì)胞黏附力，結(jié)果證實(shí)了過表達(dá)miR-200a 能增強(qiáng)癌細(xì)胞間黏附能力，使細(xì)胞間變得黏附增強(qiáng)不易遷移、減低癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，說明miR-200a 具有抑制CRC 細(xì)胞惡性生物行為的作用，結(jié)果符合現(xiàn)有關(guān)于miR-200a 的報(bào)道[12]。

雖然miR-200a 對(duì)CRC 的作用及機(jī)制有報(bào)道，且不少研究證實(shí)miR-200a 能通過調(diào)控EMT 通路上的關(guān)鍵位點(diǎn)基因從而影響腫瘤生物學(xué)行為，例如Park 等[13]、Pichler 等[14]報(bào)道在CRC 細(xì)胞HCT116 中誘導(dǎo)miR-200家族成員的過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的EMT 表型，但miR-200a 調(diào)控CRC 生物學(xué)行為的機(jī)制仍然有待深入。已經(jīng)有強(qiáng)烈的證據(jù)支持MACC1 在CRC 中的異常高表達(dá)在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等發(fā)揮重要作用，可以作為CRC 轉(zhuǎn)移、預(yù)后等預(yù)測(cè)和標(biāo)志物的作用，是新的治療靶點(diǎn)[15-16]。 該研究組前期也報(bào)道MACC1 在CRC中的高表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，是惡性進(jìn)展的促進(jìn)基因[17]。在肝癌中已經(jīng)證實(shí)miR-200a 通過靶向MACC1 抑制肝癌細(xì)胞遷移侵襲并能作為預(yù)后靶標(biāo)[18]。目前CRC 中miR-200a 和MACC1 的關(guān)系未見報(bào)道。綜合文獻(xiàn)分析和數(shù)據(jù)庫分析， 研究推測(cè)在CRC 中，miR-200a 可能通過靶向調(diào)控MACC1 影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。 該研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 上調(diào)miR-200a表達(dá)后，MACC1 表達(dá)顯著減低，在線數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-200a 與MACC1 存在一定的互補(bǔ)堿基對(duì)，MACC1 是miR-200a 的潛在靶向基因。該研究雖然沒有用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-200a 與MACC1 的直接靶向關(guān)系， 但依據(jù)肝癌中mir-200 能靶向調(diào)控MACC1 文獻(xiàn)報(bào)道[18]，可以推測(cè)出在CRC中，過表達(dá)miR-200a 通過靶向下調(diào)MACC1 表達(dá)抑制人CRC 細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，增強(qiáng)細(xì)胞黏附力。

綜上所述，過表達(dá)miR-200a 可以明顯抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲能力， 增加癌細(xì)胞同質(zhì)性黏附能力，最終阻遏CRC 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為表型， 機(jī)制是通過靶向調(diào)控抑制MACC1 實(shí)現(xiàn)的， 但miR-200a 和MACC1 的直接靶向關(guān)系及調(diào)控惡性行為的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究以明確。