黎明，劉楠楠，張健強(qiáng)，張薇，任鴻偉，蔡定均

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院，四川 成都 610075)

針灸的“治未病”思想由來已久，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)期就有對針灸治未病思想的論述，如《素問·刺熱》云：“肝熱病者,左頰先赤……病雖未發(fā),見赤色者刺之,名曰治未病?！盵1]“治未病”可分為未病先防和已病防變兩方面，未病先防旨在加強(qiáng)人體“正氣”來達(dá)到“邪不可干”的理想狀態(tài)，已病防變則著重于控制疾病的發(fā)展與傳變，即在原發(fā)病的基礎(chǔ)上，控制繼發(fā)病、并發(fā)癥與后遺癥的發(fā)生發(fā)展。預(yù)針刺是“治未病”思想的延續(xù)，指在身體無病時(shí)進(jìn)行針刺預(yù)處理從而達(dá)到“治未病”的目的，是現(xiàn)代針灸常用的一種手段[2]。

“治未病”與現(xiàn)代免疫學(xué)思想存在諸多相通之處，兩者均重視疾病的預(yù)防與控制。記憶T細(xì)胞(TM)是免疫記憶的產(chǎn)物，產(chǎn)生于細(xì)胞免疫介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程中，由少部分效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成，在參與抗感染免疫[3]、機(jī)體衰老[4]和腫瘤免疫中扮演著十分重要的角色。記憶T細(xì)胞可根據(jù)表型及功能的差異分為中央記憶性T細(xì)胞(TCM)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(TEM)。通常認(rèn)為，TCM表達(dá)CD45RO、L-選擇素CD62(CD62L)以及趨化因子受體(CCR7)，主要存在于淋巴結(jié)內(nèi)；TEM表達(dá)CD45RO，不表達(dá)或低表達(dá)CCR7和CD62L，可遷移至炎癥局部發(fā)揮免疫作用。近年來，發(fā)現(xiàn)了TM的另一亞群即組織駐留性記憶T細(xì)胞(TRM)，不同于TCM和TEM，TRM不參與外周循環(huán)，并高表達(dá)CD69或/和CD103[5]。TRM可在組織局部快速介導(dǎo)免疫反應(yīng)而無需特異性增殖[6-7]，在皮膚、胃腸道、肺臟等組織器官的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[8]。在無抗原持續(xù)刺激的條件下，TRM的定植與長期存活受局部組織微環(huán)境的影響[9]，Pan等[10]的研究也提示TRM可通過攝取游離脂肪酸并促進(jìn)脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，F(xiàn)AO)以維持其在局部的存在。針灸能調(diào)整機(jī)體固有免疫與適應(yīng)性免疫功能，改變局部免疫微環(huán)境[11]，而這種改變是否足以影響TRM的定植還不清楚。腧穴是針灸療效的基礎(chǔ)，足三里是調(diào)整機(jī)體免疫的常用腧穴之一[11]，針刺過后穴位局部組織的免疫記憶是否與腧穴的治療作用存在關(guān)聯(lián)亦是未知。因此本課題選取健康小鼠，探討 “預(yù)針刺”對小鼠足三里穴區(qū)皮膚及穴旁淋巴結(jié)記憶T細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

清潔級C57BL/6 雄性小鼠12只，9周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(川)2020-030】，喂養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物房內(nèi)【SYXK(川)2019-049】，馴化一周。動物自由攝食、進(jìn)水，控制室溫22～24℃，濕度50%～60%，隔離房每0.5 h通風(fēng)1次，自動控制光暗時(shí)間LD12:12(07:00～19:00開燈，19:00～07:00關(guān)燈)。小鼠根據(jù)體質(zhì)量完全隨機(jī)分組，分為空白組6只，預(yù)針刺組6只。本實(shí)驗(yàn)由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核通過(審批號：2014-01)，實(shí)驗(yàn)全程遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》有關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD62L抗體(美國BD公司，批號：7004854)；APC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD103抗體(美國BD公司，批號：7187747)；PerCP-CyTM5.5標(biāo)記的倉鼠抗小鼠CD69抗體(美國BD公司，批號：8024741)；PE-CyTM7標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3抗體(美國BD公司，批號：8072537)；PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD197(CCR7)抗體(美國BD公司，批號：7235504)；PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9062)；Collagenase I(英杰生命技術(shù)公司，貨號：17100017)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

蜀康牌針具(0.30×13 mm，長春愛康醫(yī)療器械有限公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)。

1.4 針刺方法

將預(yù)針刺組小鼠捆綁固定于自制固定裝置上，穴位根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]中小鼠穴位圖譜描述位置，選取右側(cè)“足三里”穴(腓骨頭下方約3 mm)手針針刺，1次/d，共10次，30 min/次，留針過程中每間隔5 min提插捻轉(zhuǎn)行針1 min。針刺時(shí)間點(diǎn)基于早期研究成果，選擇ZT12[13](19:00)時(shí)刻進(jìn)行針刺?？瞻捉M小鼠僅在相同時(shí)刻捆綁固定，不做其余處理。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

取材：小鼠經(jīng)10次針刺治療后，立刻頸椎脫臼處死，取右側(cè)“足三里”穴區(qū)皮膚組織和腹股溝淋巴結(jié)，存放于4℃PBS溶液。

流式細(xì)胞術(shù)檢測穴區(qū)TRM：剪碎穴區(qū)皮膚組織，加Collagenase I，37℃消化0.5 h，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾過后，250 g離心5 min，去上清，加入PBS控制細(xì)胞濃度到106/mL，流式管中加入細(xì)胞懸液100 μL，分別加入APC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD103抗體3 μL、PerCP-CyTM5.5標(biāo)記的倉鼠抗小鼠CD69抗體3 μL，于4℃避光孵育0.5 h，加入4℃的PBS磷酸鹽緩沖液1 mL(PH值為7.4)，混勻后250 g離心5 min，去上清，并重復(fù)該步驟后(添加PBS，離心，去上清)，添加400 μL PBS緩沖液混勻，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測穴區(qū)或淋巴結(jié)CD3+TRM:剪碎穴區(qū)皮膚或淋巴結(jié)組織，加Collagenase I，37℃消化0.5 h，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾過后，250 g離心5 min，去上清，加入PBS控制細(xì)胞濃度到106/mL，流式管中加入細(xì)胞懸液100 μL，分別加入APC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD103抗體3μL、PerCP-CyTM5.5標(biāo)記的倉鼠抗小鼠CD69抗體3μL、PE-CyTM7標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3抗體3μL，于4℃避光孵育0.5 h，加入4℃的PBS磷酸鹽緩沖液(PH值為7.4)1 mL，混勻后250 g離心5 min，去上清，并重復(fù)該步驟后(添加PBS，離心，去上清)，添加400 μL PBS緩沖液混勻，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測腹股溝淋巴結(jié)CD3+TM亞群TCM和TEM：剪碎淋巴結(jié)組織，加Collagenase I，37℃消化0.5 h，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾過后，250 g離心5 min，去上清，加入PBS控制細(xì)胞濃度到106/mL，流式管中加入細(xì)胞懸液100 μL，分別加入PE-CyTM7標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3抗體3 μL 、FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD62L抗體3 μL、PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD197(CCR7)抗體3 μL，于4℃避光孵育0.5 h，加入4℃的PBS磷酸鹽緩沖液(PH值為7.4)1 mL，混勻后250 g離心5 min，去上清，并重復(fù)該步驟后(添加PBS，離心，去上清)，添加400 μL PBS緩沖液混勻，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 “預(yù)針刺”對穴區(qū)組織TRM的影響

如表1圖1所示，與空白組相比，預(yù)針刺組CD69+CD103-TRM細(xì)胞、CD69-CD103+TRM以及總TRM細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而預(yù)針刺組CD69+CD103+TRM細(xì)胞數(shù)量多于空白組(P<0.05)。

表1 穴區(qū)組織TRM數(shù)量

圖1 穴區(qū)組織TRM數(shù)量

2.2 “預(yù)針刺”對穴區(qū)組織CD3+TRM的影響

如表2圖2所示，與空白組相比，預(yù)針刺組各類CD3+TRM亞群細(xì)胞數(shù)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白組相比，預(yù)針刺組CD3+TRM數(shù)量多于空白組(P<0.05)。

表2 穴區(qū)組織CD3+TRM數(shù)量

圖2 穴區(qū)組織CD3+TRM數(shù)量

2.3 “預(yù)針刺”對腹股溝淋巴結(jié)CD3+TM的影響

如表3圖3所示，預(yù)針刺組腹股溝淋巴結(jié)TCM、TEM、CD3+TRM以及CD3+TRM各類亞群細(xì)胞數(shù)量與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 腹股溝淋巴結(jié)CD3+TM數(shù)量

圖3 腹股溝淋巴結(jié)CD3+TM數(shù)量

2.4 “預(yù)針刺”對穴區(qū)及腹股溝淋巴結(jié)各類TM比值的影響

如表4所示，與空白組相比，預(yù)針刺組腹股溝淋巴結(jié)TRM/TCM、TRM/TEM的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 穴及腹股溝淋巴結(jié)各類TRM數(shù)量

3 討論

“治未病”思想是中醫(yī)智慧的體現(xiàn)，亦是作為“上工”的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一，即《內(nèi)經(jīng)》云：“善治者治皮毛?！盵14]它強(qiáng)調(diào)在健康狀態(tài)或發(fā)病之前采取預(yù)防措施阻止疾病的發(fā)生，同時(shí)也重視發(fā)病之后運(yùn)用針?biāo)幍仁侄伪苊饧膊〉募又?。古代醫(yī)者十分重視“治未病”思想，如孫思邈在《千金要方》中提到：“凡入?yún)鞘竦赜位拢w上常須三兩處灸之……則瘴癘溫瘧毒氣，不能著人也”[15]，張仲景《傷寒論》中也說到：“太陽病……若欲作再經(jīng)者,針足陽明使經(jīng)不傳則愈?！盵16]“預(yù)針刺”作為一種“治未病”的常用方法，亦能在未病先防和已病防變中發(fā)揮作用。在未病階段，預(yù)針刺可對心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)起保護(hù)作用[17]；在已病階段，如對于卵巢早衰患者，針刺可以緩解圍絕經(jīng)期癥狀，下調(diào)血清性激素水平，一定程度上延緩了卵巢衰竭的發(fā)生[18]。“足三里”是長壽保健的要穴，《千金方》云：“若要安，三里常不干”，現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)針刺“足三里”可對機(jī)體免疫功能產(chǎn)生積極作用[19-20]。

扶正是“治未病”思想中的重要一環(huán)，“正氣”的強(qiáng)弱和機(jī)體免疫能力密切相關(guān)。免疫是機(jī)體排除“異己”的過程，無論是外來病原體還是機(jī)體腫瘤細(xì)胞，均可成為“異己”。免疫可分為兩類，一類是與生俱來的能力即先天性免疫，另一類是后天習(xí)得的能力即適應(yīng)性免疫，TM便是在此適應(yīng)性免疫中產(chǎn)生。當(dāng)“異己”被識別時(shí)，B細(xì)胞和T細(xì)胞將會從細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮各自不同的作用，B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞與記憶B細(xì)胞(BM)，少數(shù)的T細(xì)胞分化為TM，由此產(chǎn)生免疫記憶，當(dāng)相同“異己”再次入侵時(shí)，免疫記憶被喚醒，啟動機(jī)體迅速強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。皮膚作為面積最大的器官，為機(jī)體抵御外界不良刺激和微生物入侵起到關(guān)鍵作用，同時(shí)，又是機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分。早在上世紀(jì)80年代，國外研究者便提出了皮膚免疫以及皮膚相關(guān)淋巴組織SALT(Skin-Associated Lymphoid Tissue)的觀點(diǎn)[21]，之后的研究更進(jìn)一步將皮膚定義為外周免疫器官[22]。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚中的T細(xì)胞數(shù)量多達(dá)200億，是血液系統(tǒng)中的兩倍[23]，而皮膚組織中的TM主要為TRM[24]。TRM可長期駐留于皮膚及黏膜等處，不進(jìn)入體循環(huán)，TRM可快速介導(dǎo)免疫反應(yīng)而無需依賴于體循環(huán)T細(xì)胞的補(bǔ)充[25-26]。TRM可直接裂解靶細(xì)胞，又可募集循環(huán)中CD8+TM，進(jìn)而釋放細(xì)胞因子激活自然殺傷細(xì)胞(NK)、樹突狀細(xì)胞(DCs)、T細(xì)胞和B細(xì)胞，是局部組織中發(fā)揮抗感染作用的重要免疫細(xì)胞[7,27]。TRM雖不參與外周循環(huán)，但可借助偽足在定植組織周圍來回遷移，完成“巡邏”的任務(wù)[28]。TRM可由進(jìn)入組織中的TEM或TM轉(zhuǎn)化而成，該過程受bcl-6、eomes[29]等轉(zhuǎn)錄因子以及S1P1[30]、CCR7[7]等細(xì)胞膜受體的影響，此外，局部組織微環(huán)境中IL-15、TGF-β[31]也可調(diào)控TRM的形成。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，健康小鼠皮膚中存在一定數(shù)量的TRM，其中主要以CD69+TRM為主，CD103+TRM較少；健康小鼠淋巴結(jié)CD3+TM中絕大多數(shù)為TEM，存在少量的TRM和TCM；預(yù)針刺可明顯增加穴區(qū)組織CD69+103+TRM以及CD3+TRM數(shù)量，對穴區(qū)組織CD3+TRM亞群和淋巴結(jié)CD3+TM亞群數(shù)量變化無顯著影響；預(yù)針刺對穴區(qū)TRM/淋巴結(jié)TRM比值、淋巴結(jié)內(nèi)TRM/TCM比值、淋巴結(jié)內(nèi)TRM/TEM比值均無顯著影響。

近年來科研工作者對TRM的關(guān)注度越來越高。研究證實(shí)TRM與某些皮膚病如銀屑病[32]、白癜風(fēng)[33]以及自身免疫疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、支氣管哮喘[34]的發(fā)生密切相關(guān)。在腫瘤研究方面，TRM也是關(guān)注的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，對于大體積的腫瘤，CD8+TRM可使其體積縮小，從而緩解疾病[35]。CD8+TRM浸潤程度與腫瘤患者預(yù)后正相關(guān)[36]。不僅如此，CD8+TRM可通過增加抗原傳遞細(xì)胞處理腫瘤抗原的能力來加強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)[37]。

基于以上認(rèn)識，我們有理由相信預(yù)針刺對某些感染性疾病、自身免疫疾病和腫瘤的預(yù)防和治療作用可能是通過TRM實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)不足之處在于沒有驗(yàn)證疾病狀態(tài)下，針刺是否能通過TRM阻止或延緩疾病的進(jìn)展，另外，本實(shí)驗(yàn)僅研究了足三里穴區(qū)組織TRM的變化，而不同穴區(qū)或非穴區(qū)組織TRM的數(shù)量是否存在差異仍是未知，這也將是課題組今后研究的一個(gè)方向。

綜上所述，預(yù)針刺足三里可顯著增加穴區(qū)組織記憶T細(xì)胞中的CD69+103+TRM以及CD3+TRM數(shù)量，這可能是針灸治未病應(yīng)用在感染性疾病、自身免疫疾病和腫瘤疾患中的科學(xué)基礎(chǔ)之一。