楊蕊，周蘭玉，文正瑩，陳翠平，董帥，閆婕,▲，裴瑾,▲，彭成,

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 國家中藥種質(zhì)資源庫， 四川 成都 611137)

唇形科Labiatae植物呈世界性分布，我國有99屬800余種，其中僅2020年版《中國藥典》收載以唇形科植物入藥的中藥材就有24種，具有較高的藥用價值[1-2]。唇形科藥用植物果實為小堅果，常有干而薄的外果皮，種子繁殖時常直接將小堅果用來播種，本文中統(tǒng)稱為種子。該科種子常存在由萌發(fā)抑制物質(zhì)引起的生理休眠(Physiological Dormancy,PD)，使得在實際栽培生產(chǎn)中萌發(fā)率低[3-4]。本試驗通過對國家中藥種質(zhì)資源庫收集的不同批次的丹參、廣藿香、薄荷及黃芩種子進行質(zhì)量評價及萌發(fā)特性研究，有利于中藥材的規(guī)范化栽培，保障優(yōu)質(zhì)中藥的生產(chǎn)，為中藥種子入庫標準的建立積累數(shù)據(jù)，為國家中藥種質(zhì)資源庫保存和利用唇形科植物種子提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 材料

試驗所用實驗材料由國家中藥種質(zhì)資源庫采集組采集，在干燥間(溫度15℃，濕度15%RH)干燥至含水量5%～7%后，存放于-20℃低溫庫保存。四種唇形科植物的不同批次種子采集情況見表1(編號為入庫編號末尾三位數(shù))。

表1 唇形科4種植物不同批次種子采集信息

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器

SteREO Discovery.V12體式顯微鏡及成像系統(tǒng)(德國Carl Zeiss)；MX-20射線輻射成像系統(tǒng)(美國Faxitron)；Selecta ZZ1.0 種子風(fēng)選儀(德國Petkus)；TJD-1300種子凈度工作臺(浙江托普儀器有限公司)；GTOP-260B智能光照培養(yǎng)箱(浙江托普儀器有限公司)；mili-Q純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；JA1003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2.2 試藥

瓊脂粉(批號：2020120401)及赤霉素(批號：2019101401)購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，萘乙酸(批號：C11926791)及6-芐基腺嘌呤(批號：C11457727)購自上海麥克林生化科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 取樣

用分樣板將樣品在玻璃板上多次混合后攤成四方形，劃兩條對角線，取對頂三角形內(nèi)的樣品繼續(xù)按上述方法分取，直至2個三角形內(nèi)的樣品接近2份試驗樣品的重量[5]。

2.2 種子及幼苗形態(tài)觀察

每批種子選取20粒，游標卡尺測量其長和寬，再取5～10粒種子，于體視境下觀察外觀形態(tài)并采集圖片；觀察萌發(fā)后幼苗的形態(tài)、顏色等，于掃描儀下掃描拍照。

2.3 凈度

調(diào)節(jié)風(fēng)速，用風(fēng)選儀除去相對實驗樣品重量較輕及較重的雜質(zhì)，接著過篩或手工挑選，除去蟲蛀、干癟及雜種子及泥沙等雜質(zhì)[6]。

種子凈度(%)=凈選后種子重量/供檢種子質(zhì)量×100%

2.4 健康度

每批取50粒種子，X-射線拍照。健康種子應(yīng)飽滿且結(jié)構(gòu)完整；胚呈半透明狀或有裂紋、孔道等。種子需剪切確認是否空癟、變質(zhì)或蟲蛀，記錄最終健康種子數(shù)目[7]。

健康度(%)=健康種子數(shù)/檢測種子數(shù)×100%

2.5 千粒重

五十粒法測定。從樣品中取出50粒，電子天平稱重(精確度為0.001 g)，每批重復(fù)3次，計算每個重復(fù)的平均值、變異系數(shù)和標準差[8]。

變異系數(shù)(%)=標準差/平均值×100%

2.6 唇形科種子萌發(fā)特性的研究

2.6.1 培養(yǎng)基的配制

采用1%瓊脂培養(yǎng)基，按照瓊脂粉:水為1∶100往沸水中添加瓊脂粉，煮至瓊脂液澄清透明，晾至不燙手倒入一次性培養(yǎng)皿(1/2左右處)，凝固后塑封袋密封，倒置放入冰箱4℃冷藏備用。若配制含激素的培養(yǎng)基，需先配制1%瓊脂水溶液，再稱量適量激素加入瓊脂液中攪拌至融化即可。

2.6.2 不同處理對種子萌發(fā)的影響

丹參種子每批選取90粒(播3盤，30粒/盤)，廣藿香、薄荷種子每批次選取150粒(播3盤，50粒/盤)，黃芩種子選取105粒(播3盤，35粒/盤)，分別在25℃、25℃+劃破果皮及15/25℃變溫(12 h，12 h)下培養(yǎng)，光照2 000 lx。以胚根長出2 mm 為發(fā)芽標準，15 d后終止實驗，每日記錄數(shù)據(jù)，重復(fù)3次實驗。丹參、黃芩計算第4天萌發(fā)勢，廣藿香及薄荷分別計算第3天萌發(fā)勢及第5天萌發(fā)勢。

萌發(fā)率= 試驗結(jié)束發(fā)芽種子總數(shù)/供檢種子總數(shù) ×100%

萌發(fā)勢= 規(guī)定日數(shù)內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供檢種子總數(shù) ×100%

2.6.3 外源植物激素對種子萌發(fā)的影響

每種挑選一批次進行試驗，考察不同濃度的外源赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)及6-芐基腺嘌呤(6-BA)對唇形科種子萌發(fā)的影響。按照以下濃度將外源植物激素配置入瓊脂培養(yǎng)基中：

GA3(mg/L)：50、100、200、300、500；

NAA(mg/L)：10、25、50、100、200；

6-BA(mg/L)：10、25、50、100、200。

每種種子在同一濃度條件下平行播3盤(廣藿香、薄荷50粒/盤；丹參、黃芩30粒/盤)，丹參、黃芩于15/25℃下培養(yǎng)，其余種子在25℃下培養(yǎng)，其中廣藿香及黃芩需劃破果皮，光照均為2 000 lx。按2.6.2項下方法觀察、計算萌發(fā)率和萌發(fā)勢。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析方法

將所得到的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進行處理，測定結(jié)果表示為(平均值±標準偏差)形式，用SPSS 25.0進行顯著性分析，SigmaPlot 12.5進行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 種子及幼苗形態(tài)觀察[9]

3.1.1 丹參

丹參種子(實為果實)為棕褐或灰黑色，三棱狀長橢圓形，長2.6～3.5 mm，寬1.3～3.0 mm。兩頭略尖或圓鈍，背面拱凸或?qū)拡A，腹面隆起成脊，圓形果臍位于縱脊基部，表面光滑無毛，斜面邊緣圓滑。幼苗子葉2，墨綠色，卵圓形，長4.1～5.5 mm，寬3.5～4.0 mm，初生葉對生。胚軸圓柱形，遠端白色，向上漸變?yōu)榫G色。根長，常附細密根毛(見圖1)。

注：左圖種子；右圖萌發(fā)1～8 d的幼苗

3.1.2 廣藿香

廣藿香種子(實為果實)為黃棕或棕褐色，三棱狀長橢圓形，長1.4～1.9 mm，寬0.7～1.0 mm。頂端圓鈍，背面略拱，腹面由兩斜面組成，形成銳縱脊；果實一端被黃白色絨毛，一端有三角形果臍。幼苗子葉2，紙質(zhì)，橢圓形，黃綠色，長2.2～3.0 mm，寬1.3～2.0 mm；初生葉對生，披針形。胚軸由淺綠色漸變?yōu)榍嗑G色。主根長，側(cè)根近水平伸展(見圖2)。

注：左圖種子；右圖萌發(fā)1～7 d的幼苗

3.1.3 黃芩

黃芩種子(實為果實)呈三棱狀橢圓形，長2.0～2.3 mm，寬1.0～1.8 mm。表面黑色，粗糙，密布疣狀突起，背面隆起呈弓狀，腹面相應(yīng)弓狀凹進，側(cè)面具斜溝，相交于腹棱中上部的果臍處，灰白色果臍圓點狀。幼苗子葉2，寬卵形或長橢圓形被灰白色絨毛，長2.4～5.5 mm，寬1.5～4 mm。初生葉對生，線狀披針形。胚軸圓柱形，白色或紅棕色；根長，常附根毛，偶見側(cè)根(見圖3)。

注：左圖種子；右圖萌發(fā)1～7 d的幼苗

3.1.4 薄荷

薄荷種子(實為果實)呈灰黑色或黑色，三棱狀橢圓形，長1.6～2.0 mm，寬0.9～1.4 mm。表面光滑或粗糙，背面圓鈍拱起，腹面形成縱脊，果臍生于縱脊基部，形似三角形，兩端圓鈍。幼苗子葉2，長卵形或心形，長2.0～3.5 mm，寬1.0～2.7 mm。初生葉對生，長卵形，邊緣鋸齒狀。胚軸下部白色，上部漸變?yōu)闇\綠色。主根長，可見側(cè)根，斜向下伸展(見圖4)。

注：左圖種子；右圖萌發(fā)1～8 d的幼苗

3.2 凈度分析

丹參中雜質(zhì)主要為碎葉、雜種子及空癟種子，其中421批次的凈度僅有30.62%。廣藿香凈度均在88%以上。黃芩種子除407批次凈度僅有47.10%外，其余凈度在75.39%～94.56%之間。薄荷種子凈度均在88.64%以上(見圖6)。

3.3 健康度

丹參種子健康度在68%～94%之間，421批次的健康度最高，363批次的最低。廣藿香、黃芩、薄荷等種子的健康度均在94%～100%之間(見圖5～6)。

圖5 唇形科4種種子X-Ray檢測圖

圖6 唇形科4種種子的凈度和健康度

3.4 千粒重

唇形科4種種子千粒重的變異系數(shù)皆小于4%，測定值真實可靠[10]。丹參種子的千粒重在1.61～2.08 g之間；廣藿香千粒重在0.42～0.46 g之間；黃芩在1.41～2.11 g之間；薄荷在0.62～0.83 g之間(見圖7)。

圖7 唇形科四種種子的千粒重及變異系數(shù)

3.5 唇形科種子萌發(fā)特性研究

3.5.1 不同處理對種子萌發(fā)的影響

丹參[11-14]、廣藿香[15-17]、黃芩[18-20]、薄荷[21-22]等唇形科植物主要分布在我國的溫帶地區(qū)，其適宜萌發(fā)溫度一般在15～25℃之間，因此設(shè)置25℃恒溫和15/25℃變溫來考察最適宜萌發(fā)溫度。用于萌發(fā)的種子實為小堅果，果皮較厚硬，可能影響種子萌發(fā)，因此在25℃恒溫條件下，比較劃破果皮與不做特殊處理對種子萌發(fā)的影響。

丹參種子的萌發(fā)率為53.33%～66.39%，萌發(fā)勢在47.27%～48.33%之間，組間雖無顯著差異，但變溫處理仍獲得了最高的萌發(fā)率，這與李曉琳[11]等認為變溫可促進丹參萌發(fā)一致。廣藿香的萌發(fā)率在64.29%～74.76%之間，萌發(fā)勢在46.38%～62.10%之間，劃破果皮對提高萌發(fā)率有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，15/25℃變溫會顯著降低萌發(fā)率和萌發(fā)勢，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黃芩的萌發(fā)率在80%以上，萌發(fā)勢為57.89%～61.00%。劃破果皮和變溫條件均能顯著提高種子萌發(fā)率，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。薄荷的萌發(fā)率在63.33%～68.83%之間，各處理組間萌發(fā)率無顯著差異，15/25℃變溫會顯著降低萌發(fā)勢，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表2 唇形科種子的萌發(fā)率及萌發(fā)勢

3.5.2 外源植物激素對唇形科種子萌發(fā)的影響

外源植物激素是常用的促進種子迅速均勻出苗的方法之一，其中赤霉素、生長素及細胞分裂素是常用的三種類型。文獻報道，赤霉素(GA3)能有效解除臘梅[23]、牡丹[24]、山桃[25]等種子的休眠；生長素萘乙酸(NAA)可在一定濃度內(nèi)促進薄荷種子萌發(fā)；而細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)可促進果蔬[26]、鐵線蓮[27]等種子萌發(fā)，解除休眠。根據(jù)前期實驗結(jié)果，選擇質(zhì)量較優(yōu)的338(丹參)、398(廣藿香)、045(黃芩)、620(薄荷)批次種子，進行外源植物激素實驗，結(jié)果見表3。

表3 不同外源植物激素處理后四種唇形科種子的萌發(fā)情況

在不同濃度的GA3中50 mg/L的GA3處理丹參種子的效果最佳。GA3處理后的廣藿香及黃芩的萌發(fā)率及萌發(fā)勢均高于空白對照，50～300 mg/L的GA3對促進廣藿香萌發(fā)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這與高贏[17]等認為GA3可在一定程度上提高廣藿香種子的萌發(fā)率的觀點一致。黃芩種子萌發(fā)率均顯著高于對照組(P<0.05)，增幅為7.77%～13.33%，同時100 mg/L及500 mg/L的GA3對黃芩的萌發(fā)勢的提高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GA3對薄荷種子的萌發(fā)影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這與劉玉萍[21]等認為的100～300 mg/L GA3能顯著提高青海野薄荷的萌發(fā)率及萌發(fā)勢的觀點不一致。

NAA對四種唇形科種子的萌發(fā)率呈先促進后抑制的趨勢，萌發(fā)勢隨激素濃度升高而顯著下降(P<0.05)。另外，NAA處理組的胚根較空白組的明顯縮短，根略膨大，子葉和莖發(fā)育正常，長霉較嚴重。低濃度NAA(10 mg/L)處理組的萌發(fā)率較空白組有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其他處理組萌發(fā)率降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。薄荷的萌發(fā)情況與牛文昊[22]等認為80～100 mg/L的NAA可促進薄荷萌發(fā)的觀點不一致。

丹參、薄荷種子的萌發(fā)率隨6-BA濃度升高而下降，25～200 mg/L的6-BA處理組表現(xiàn)抑制萌發(fā)作用(P<0.05)。廣藿香種子的萌發(fā)率隨激素濃度增加呈先升后降的趨勢，其中50 mg/L及100 mg/L處理組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。6-BA處理能提高黃芩的萌發(fā)率(P<0.05)，增幅為7.77%～13.33%。但四種唇形科種子的萌發(fā)勢均隨6-BA濃度升高而降低(P<0.05)。

2. 表中的外源植物激素濃度編號1～5分別為，GA3(mg/L)：50、100、200、300、500；NAA或6-BA(mg/L)：10、25、50、100、200；CK為空白對照

綜上所述，三種外源植物激素對唇形科種子的萌發(fā)影響顯著。一定濃度GA3可提高丹參、廣藿香、黃芩和薄荷四種唇形科種子的萌發(fā)率及萌發(fā)勢，能夠較好的打破唇形科種子的生理休眠，促進種子萌發(fā)。10 mg/L的NAA處理可提高四種唇形科種子的萌發(fā)率，一定濃度的6-BA處理可提高廣藿香與黃芩種子的萌發(fā)率，但四種種子的萌發(fā)勢均隨激素濃度升高顯著降低，發(fā)芽速度相對減慢。因此，GA3有利于唇形科植物種子的萌發(fā)；一定濃度的NAA及6-BA可提高部分唇形科種子的萌發(fā)率，但影響幼苗形態(tài)發(fā)育及胚根生長，不利于唇形科種子的萌發(fā)。

4 結(jié)論與討論

常用藥用植物種質(zhì)資源的保存，有利于保存優(yōu)質(zhì)中藥的基因多樣性，為中藥材良種選育提供物質(zhì)基礎(chǔ)。種子的質(zhì)量將直接影響藥材的質(zhì)量和均一性，是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展的重要基石。丹參、黃芩、廣藿香和薄荷為來源于唇形科植物的常用中藥，黃芩主要用種子繁殖，也可扦插或分根繁殖；丹參常用分根繁殖，也可用種子或扦插繁殖；薄荷常用種子或扦插繁殖；廣藿香常扦插繁殖。唇形科植物種子為正常型種子(Orthodox Seed)，可以在種子庫的低溫和干燥條件下實現(xiàn)長期保存。唇形科植物種子常均有生理休眠，

圖8 三種激素處理四種唇形科種子的萌發(fā)情況

一定濃度的赤霉素處理可打破種子的生理休眠，提高種子萌發(fā)率或萌發(fā)勢；種子實為小堅果，果皮較為堅硬，劃破果皮處理也可提高某些種子的萌發(fā)率和萌發(fā)勢。本實驗將一定濃度的激素添加到瓊脂培養(yǎng)基中，該處理方法能確保激素處理的濃度在實驗過程中穩(wěn)定、可控，實驗數(shù)據(jù)更為可靠。四種唇形科種子以萌發(fā)率及萌發(fā)勢為評價指標，最佳萌發(fā)條件分別為：丹參種子15/25℃，50 mg/L GA3培養(yǎng)基；廣藿香種子25℃，劃破果皮，50～300 mg/L GA3培養(yǎng)基；黃芩種子15/25℃，劃破果皮，50～500 mg/L GA3培養(yǎng)基；薄荷種子25℃；光照均為2 000 lx，為種子庫對唇形科種子的評價、研究與利用提供可借鑒的標準化操作。

國家中藥種質(zhì)資源庫收集的種子在入庫前及保存過程中都需進行質(zhì)量檢測，以保證庫藏的種子具有較高的活力。查閱中藥相關(guān)種子種苗標準可知，四種唇形科種子均未見國家標準，在四川、陜西、安徽、河北省地方標準有丹參[28-29]、黃芩[30-31]和薄荷[32]種子標準的收載。分析實驗結(jié)果可知，在最佳萌發(fā)條件下，丹參及黃芩種子萌發(fā)率能達到85%以上，廣藿香和薄荷的萌發(fā)率在75%以上，黃芩可以達到DB34/554-2005黃芩種子發(fā)芽率85%的標準；實驗丹參種子用GA3處理打破休眠后萌發(fā)率遠超過DB51/T1044-2010的發(fā)芽率25%和DB61/1102-2017d的發(fā)芽率55%的標準；丹參種子凈度、個別黃芩種子千粒重及凈度不能達到相關(guān)標準，提示種子入庫前應(yīng)有規(guī)范的凈選環(huán)節(jié)。實驗薄荷種子萌發(fā)率為78%，未達到DB/T 2704-2018發(fā)芽率80%的標準，可能與種子的采收期有關(guān)，還需進一步實驗驗證。參照地方中藥種子標準以及實驗數(shù)據(jù)，目前已建立相應(yīng)物種的國家中藥種質(zhì)資源庫入庫標準。黃芩種子萌發(fā)率低于80%，丹參、薄荷和廣藿香種子萌發(fā)率低于70%視為不合格種子，應(yīng)重新采集。種子入庫標準為國家中藥種質(zhì)資源庫的有效運行提供科學(xué)依據(jù)。