年婧，景軍強(qiáng) ，趙重博 ，辛玲歌，翟夏▲，孫靜

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西一方平康制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

椒目Zanthoxyli Semen為蕓香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.和青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.的干燥成熟種子，由于青椒產(chǎn)地分布狹窄，其種子未形成商品規(guī)模，故商品椒目多為花椒的干燥成熟種子[1]。椒目始載于《本草經(jīng)集注》，《本草綱目》記載其“下達(dá)，能通滲道，不行谷道，所以能下水燥濕，定喘消脹也”，臨床上多用于水腫脹滿，痰飲喘逆癥?，F(xiàn)代藥理研究表明椒目對(duì)高脂血癥有較大治療潛力，對(duì)小鼠、家兔以及細(xì)胞層面都表現(xiàn)出良好的改善血脂作用[2-5]。椒目中的化學(xué)成分主要為脂肪酸、揮發(fā)油及氨基酸，其中椒目皮油主要含棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸和亞油酸，椒目仁油主要含亞麻酸，其中不飽和酸含量在90 %以上。椒目仁油所含主要成分α-亞麻酸具有多種活性，如抑制血栓形成、預(yù)防老年癡呆、防治過(guò)敏性哮喘和降血脂等[6-8]，已有的研究顯示椒目仁油可以改善血液中的脂質(zhì)分布，同時(shí)通過(guò)蛋白激酶A途徑磷酸化引起活化激素敏感脂肪酶(Hormone-Sensitive Lipase)降解細(xì)胞脂質(zhì)，最終導(dǎo)致脂肪分解，起到改善血脂水平的作用[2,9-10]。因此椒目仁油在保健品研發(fā)方面有很廣闊的發(fā)展前景。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)可以篩選出對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著的因素，Box-Behnken效應(yīng)面法具有實(shí)驗(yàn)精度高的特點(diǎn)，兩者結(jié)合在工藝優(yōu)化研究中被廣泛使用[11-12]。目前椒目仁油提取廣泛采用壓榨技術(shù)、索氏回流提取、超臨界CO2流體萃取等[13-15]。超聲可以有效地破壞種子的細(xì)胞壁，微波具有優(yōu)秀的穿透性，加熱效率非常高，這兩種技術(shù)也常配合應(yīng)用于植物油提取中[16-17]。本次實(shí)驗(yàn)使用超聲-微波聯(lián)用萃取儀優(yōu)化椒目仁油提取工藝，同時(shí)采用高脂飲食建立大鼠高脂血模型評(píng)價(jià)所提取的椒目仁油降血脂作用，以期為椒目的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

椒目藥材購(gòu)自陜西省韓城市芝陽(yáng)花椒市場(chǎng)(批號(hào)：20191003)；α-亞麻酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度>99.0%，批號(hào)：111631-200502)；十四酸(上海振譜生物有限公司，純度>99.5%，批號(hào)：180715)；阿托伐他汀鈣膠囊(天方藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20181108)；正己烷、氫氧化鉀、氫氧化鈉等均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.2 儀器

SCIENTZ-IIDM微波光波超聲波萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，磁力攪拌轉(zhuǎn)子離心半徑r=1.4 cm)；TG臺(tái)式離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BT25S型分析天平(賽多利斯上海貿(mào)易有限公司)；7890A氣相色譜儀配電子捕獲檢測(cè)器-MS 5977B(美國(guó)安捷倫公司)；TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200728，20200702，20200921，20200613)；TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝株式會(huì)社)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，72只，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK(陜)2014-003，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例的要求。MD12032動(dòng)物高脂飼料和普通飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 椒目仁油中α-亞麻酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

參考文獻(xiàn)條件[18-19]，使用PEG-20M毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.5μm)，柱溫：190℃，進(jìn)樣口溫度：250℃，檢測(cè)器溫度：250℃；載氣：氮?dú)?99.99%)；燃?xì)猓簹錃猓?0 mL/min，空氣,400 mL/min；進(jìn)樣量：5μL，分流比：25∶1。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱定十四酸10 mg，置具塞錐形瓶中，加入 0.5 mol/L 氫氧化鉀-甲醇溶液 1 mL，于 60℃水浴加熱 30 min，取出，放冷。加入 14%三氟化硼-甲醇溶液 1 mL，于 60℃水浴加熱 20 min，取出，放冷。精密加入正己烷10 mL，充分振搖，加入飽和氯化鈉溶液 15 mL，搖勻，靜置。精密移取上層續(xù)濾液，定容至25 mL容量瓶，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取椒目藥材100 g，加適量1.4%NaOH水溶液，60℃攪拌30 min除去表面油脂[20]。取適量殘?jiān)虼址?，置提取瓶中，加?0倍正己烷，設(shè)置微波-超聲波萃取儀參數(shù)：微波功率300 W，微波時(shí)間120 s，超聲功率300 W ，超聲10 min，轉(zhuǎn)速100 r/m。提取完成后離心過(guò)濾，濾液減壓回收正己烷，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上低溫蒸干，于干燥器中干燥24 h，即得椒目仁油固形物。(椒目仁油含油率=椒目仁油固形物質(zhì)量/椒目藥材質(zhì)量×100%)

取上一步制備所得的椒目仁油固形物100 mg，加入內(nèi)標(biāo)十四酸10 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照“2.1.2”項(xiàng)下十四酸溶液的方法配制，作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密取α-亞麻酸對(duì)照品10 mg，20 mg，30 mg，40 mg，50 mg，均加十四酸10 mg，置具塞錐形瓶中，照“2.1.2”項(xiàng)下十四酸溶液的方法配制，作為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用氣相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣，分別測(cè)定不同濃度對(duì)照品溶液中十四酸和α-亞麻酸峰面積，計(jì)算其比值，以十四酸和α-亞麻酸峰比值為縱坐標(biāo)，以α-亞麻酸濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性關(guān)系。

2.1.5 方法學(xué)研究

將加入內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，以α-亞麻酸峰面積與十四酸峰面積比值計(jì)算精密度RSD值；取6份100 mg椒目仁油分別加十四酸10 mg照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品，以α-亞麻酸峰面積與十四酸峰面積比值計(jì)算重復(fù)性RSD值；同一樣品分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h設(shè)置進(jìn)樣，以α-亞麻酸峰面積與十四酸峰面積比值計(jì)算樣品穩(wěn)定性RSD值；取50 mg椒目仁油6份加10 mg十四酸和適量α-亞麻酸對(duì)照品照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品進(jìn)樣，以α-亞麻酸峰面積與十四酸峰面積比值計(jì)算平均加樣回收率及RSD值。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert軟件的Plackett-Burman模塊，選擇粉碎粒徑50～80目，料液比6～10倍，微波功率300～500 W，微波時(shí)間60～120 s，超聲功率200～400 W，超聲時(shí)間6～12 min，攪拌速度60～120 r/m，考察各因素對(duì)椒目仁油提取率和α-亞麻酸含量綜合評(píng)分的影響，采用總評(píng)歸一值法[21][利用Hassan 法對(duì)各效應(yīng)值進(jìn)行歸一化，本次實(shí)驗(yàn)的椒目仁油提取率和化學(xué)成分含量越高越好，因此，歸一值di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，再對(duì)歸一值求幾何平均值，OD=(d1，d2，…，dn)1/n] 研究各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響差異。

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選

在單因素試驗(yàn)和PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以椒目仁油提取率和α-亞麻酸含量OD值為自變量，以微波功率、微波時(shí)間和超聲功率為因變量，根據(jù)Design Expert軟件的Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)?zāi)K進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選椒目仁油的最佳提取工藝。

2.4 提取工藝參數(shù)驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)際條件的可操作性，按照優(yōu)化工藝條件提取3次椒目仁油，并與BBD實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2.5 椒目仁油降血脂作用研究

2.5.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥[22]

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為空白對(duì)照組，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、椒目仁油高劑量組、中劑量組、低劑量組。除正常對(duì)照組外其余五組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)，正常對(duì)照組給予普通飼料。飼養(yǎng)4周后確認(rèn)造模成功，保證每組大鼠10只，開(kāi)始給藥。對(duì)照組和模型組灌胃生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃7.5 mg/kg的阿托伐他汀膠囊內(nèi)容物，給藥組依次給予椒目仁油100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg，給藥劑量參考文獻(xiàn)[2-4]，每天一次，連續(xù)4周。給藥4周后即實(shí)驗(yàn)第8周進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.5.2 樣本采集

喂養(yǎng)4周后，禁食過(guò)夜，眼眶取血1.5 mL，室溫下靜置1 h，3 500 r/min(4 375×g)離心10 min 后取出上清液，按試劑盒要求對(duì)血清進(jìn)行處理，分別測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C 及LDL-C 的水平，確定造模成功后，棄除不符合要求大鼠。

末次給藥后，禁食12 h (飲水不限)，眼眶取血1.5 mL，同上法處理，測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。

2.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 椒目仁油中α-亞麻酸含量測(cè)定

十四酸、α-亞麻酸和椒目仁油樣品的氣相色譜圖見(jiàn)圖1，內(nèi)標(biāo)和樣品中色譜峰不存在干擾。以α-亞麻酸峰面積與十四酸峰面積比值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=103.27X+0.0478(R2=0.998 6)，表明α-亞麻酸質(zhì)量濃度在0.008～0.04 mg/mL呈良好線性關(guān)系。精密度RSD為0.24%；重復(fù)性RSD為1.12%；24 h內(nèi)穩(wěn)定性RSD為1.07%；平均加樣回收率為98.97%，RSD為0.84%。

圖1 椒目仁油樣品氣相色譜圖

3.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)優(yōu)選結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert軟件的Plackett-Burman模塊對(duì)因素水平(-1、1)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 PB實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)因素和結(jié)果進(jìn)行方差分析，對(duì)模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢查，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 PB實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表3 可以看出，所建立的模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明該模型可用于椒目提取因素的分析。其中微波功率對(duì)椒目仁油提取率和α-亞麻酸含量影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，微波時(shí)間和超聲功率的影響也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，故將此3個(gè)因素作為下一步響應(yīng)面法優(yōu)化的因素。粉碎粒徑、浸泡溫度、浸泡時(shí)間、超聲溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，因此結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇椒目粉碎粒徑65目，加8倍量正己烷，超聲時(shí)間9 min，轉(zhuǎn)速90 r/m作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)條件。

3.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選結(jié)果

BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 因素水平表

表5 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與效應(yīng)值

對(duì)星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以椒目提取OD值為響應(yīng)值，對(duì)微波功率、微波時(shí)間和超聲功率進(jìn)行多元線性回歸二項(xiàng)式方程擬合，擬合的方程模型為OD=-10.82+0.052×微波功率+0.019×微波時(shí)間+0.000 50×超聲功率-0.000 1×微波功率×微波時(shí)間-0.000 000 30×微波功率×超聲功率+0.000 002 0×微波時(shí)間×超聲功率-0.000 006 0×微波功率2-0.000 01×微波時(shí)間2-0.000 000 90×超聲功率2(R2=0.997 6；RAdj2=0.994 4)，對(duì)模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)檢查，結(jié)果見(jiàn)表6。二項(xiàng)式模型P<0.000 1，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，可用此模型和方程來(lái)分析預(yù)測(cè)最佳提取工藝條件，OD值提取率與任意2個(gè)因素的三維效應(yīng)面曲線見(jiàn)圖2。以O(shè)D值最大值為目標(biāo)，根據(jù)“Design Expert 8.05 b”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得最佳椒目仁油提取工藝參數(shù)為：粉碎粒徑65目，8倍量正己烷，微波功率392.01 W處理82.94 s，超聲功率297.01 W處理9 min，轉(zhuǎn)速90 r/m，OD值預(yù)測(cè)最大值0.999 5。

表6 實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

3.4 提取工藝參數(shù)驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)際條件的可操作性，將工藝條件優(yōu)化為：椒目藥材粉碎粒徑65目,8倍量正己烷，微波功率392 W處理83 s，超聲功率297 W處理9 min，轉(zhuǎn)速90 r/m，結(jié)果見(jiàn)表7。椒目仁油平均提取率為17.41%，α-亞麻酸含量為32.05%，平均OD值為1.069 0，接近且大于預(yù)測(cè)值，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.5 椒目仁油對(duì)高脂血模型大鼠影響結(jié)果

造模4周，與正常組比較，造模大鼠血清TC、TG、LDL-C 均升高(P<0.01)，HDL-C降低(P<0.01)，說(shuō)明模型復(fù)制成功，且治療組與模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后再給藥4周，椒目仁油高中低劑量組均在一定程度上回調(diào)各項(xiàng)指標(biāo)。其中高劑量組椒目仁油對(duì)高脂血模型大鼠的改變最明顯(P<0.01，P<0.05)，中劑量組對(duì)TC、TG和LDL-C三個(gè)指標(biāo)作用明確(P<0.01，P<0.05)，低劑量組對(duì)TC和TG指標(biāo)作用明確(P<0.01)，對(duì)HDL-C和LDL-C有所回調(diào)，但是與模型組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明椒目仁油對(duì)高脂血癥大鼠有明顯的降血脂作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，濃度在300 mg/kg時(shí)作用明顯(見(jiàn)表8)。

表8 大鼠血脂測(cè)定結(jié)果

4 討論

椒目仁油含有大量的不飽和脂肪酸，如油酸和亞麻酸，KimKyoung Kon[2]等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示椒目油可以改善血液中的脂質(zhì)分布、降解細(xì)胞脂質(zhì)，最終導(dǎo)致脂肪分解，達(dá)到改善血脂水平的目的。肖會(huì)敏[4]等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示椒目仁油降血脂的作用主要依賴其中不飽和脂肪酸即α-亞麻酸,其降血脂的效果隨著椒目仁油劑量的增加而加強(qiáng),同時(shí)隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。

圖2 椒目仁油提取各因素對(duì)響應(yīng)值的等高線和效應(yīng)面圖

目前椒目仁油(花椒籽油)的提取方法主要采用壓榨技術(shù)、索氏回流提取、超臨界萃取法、水酶法等，劉通等采用超臨界萃取經(jīng)堿皂化后的花椒籽得油率為19.98%[23]，吳珺婷等采用纖維素酶和中性蛋白酶水相酶解及正己烷萃取花椒籽得油率為11.2%[24]，李霞等采用微波輔助優(yōu)化脫蠟花椒籽得油率為18.68%[25]，徐文秀等采用超聲輔助優(yōu)化脫蠟花椒籽得油最優(yōu)得率為27.25%[26]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)微波-超聲同時(shí)提取研究椒目仁油的最優(yōu)提取工藝，相比常規(guī)的提取方法有著溶劑使用量少，提取時(shí)間短以及提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)槲⒉〞?huì)瞬間穿透物料內(nèi)部快速加熱，但是要保證合適的功率和加熱時(shí)間，否則會(huì)導(dǎo)致中藥熱敏性成分發(fā)生變化，超聲則會(huì)增加溶液中分子的相對(duì)運(yùn)動(dòng)頻率。椒目藥材粉碎粒徑越小，表面積越大，提取效率越高，但是當(dāng)粒徑過(guò)于細(xì)小，容易與油粘結(jié)成團(tuán)，不利于團(tuán)塊內(nèi)部的成分的溶出。本研究?jī)?yōu)化的超聲-微波聯(lián)用工藝相比單獨(dú)的超聲提取工藝實(shí)現(xiàn)了椒目仁油提取率為17.41%，α-亞麻酸的含量為32.05%，若按經(jīng)NaOH水溶液皂化后重量計(jì)(100 g椒目處理后得干燥殘?jiān)s78.21 g)本研究最終椒目仁得油率為22.32%。相比已有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究所得椒目仁油的得率并不是最高，與研究對(duì)象椒目自身的含油率及是否已經(jīng)經(jīng)過(guò)脫蠟工藝有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)制備所得椒目仁油能明顯降低大鼠血脂中TC、TG、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平，改善血脂代謝，其中高劑量椒目仁油干預(yù)效果接近陽(yáng)性對(duì)照藥阿托伐他汀。研究結(jié)果為椒目的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了一定的借鑒。