來(lái)夢(mèng)茹，孫思雅，方昀，陳建真，葛宇清，張光霽，程汝濱▲

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

海馬是海洋動(dòng)物類(lèi)藥材，具補(bǔ)腎壯陽(yáng)益精、活血散結(jié)、消腫止痛等功效[1]。《中國(guó)藥典》2015年版收載了五種藥用海馬，分別為小海馬Hippocampusjaponicus、大海馬H.kuda、刺海馬H.histrix、線紋海馬H.kelloggi、三斑海馬H.trimaculatus的干燥體[2]。藥用海馬在中醫(yī)藥領(lǐng)域中占有重要地位，但過(guò)度捕撈開(kāi)采使海域中的野生海馬資源逐漸貧乏，我國(guó)海馬藥材供不應(yīng)求，進(jìn)口和走私現(xiàn)象日益增多。目前中藥材市場(chǎng)上的海馬品種繁多，名稱(chēng)混淆不清、混用替代的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，非藥典品種的偽品的流通使用，嚴(yán)重降低了海馬藥材的醫(yī)療保健價(jià)值，破壞了中藥材市場(chǎng)秩序，而且對(duì)海馬本身的開(kāi)發(fā)利用也有一定危害[3-4]。

太平洋海馬(Hippocampusingens)是一種東太平洋特有的海馬，野生資源豐富，幼崽存活率高，適應(yīng)性好[5]。太平洋海馬體型巨大，符合臨床以海馬體型大為質(zhì)量佳的用藥習(xí)慣，故常被作為藥典品種大海馬的偽品流通使用，是目前中藥材市場(chǎng)主要流通的非藥典海馬品種之一，市場(chǎng)銷(xiāo)售量占比高達(dá)11.95%[6]。目前關(guān)于太平洋海馬的基礎(chǔ)研究工作仍處于起步階段，因缺乏最基本的藥材性狀特征和DNA條形碼序列等基本的生藥學(xué)信息，限制了對(duì)太平洋海馬的進(jìn)一步研究，迫切需要加強(qiáng)太平洋海馬的鑒定和開(kāi)發(fā)等相關(guān)研究工作。因此，本文擬建立太平洋海馬的DNA條形碼鑒定技術(shù)，明確其典型性狀特征及COI和ATP6條形碼的分子鑒定能力，為太平洋海馬的快速準(zhǔn)確鑒定提供技術(shù)保證。

1 材料

1.1 藥材

本實(shí)驗(yàn)共收集25份來(lái)自不同地區(qū)藥材市場(chǎng)及海馬養(yǎng)殖廠的海馬藥材樣品。所有海馬干燥體樣品經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院葛宇清副研究員鑒定，確認(rèn)為太平洋海馬(H.ingens)、三斑海馬(H.trimaculatus)、直立海馬(H.erectus)、棘海馬(H.erectus)和小海馬(H.japonicus)的藥用干燥體。將所有樣品標(biāo)記名稱(chēng)后，于潔凈密封袋中避光保存，樣品保存于浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。同時(shí)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載9條未收集到的海馬和海龍的COI和ATP6序列(含線紋海馬3條，大海馬2條，刺海馬2條，擬海龍和刁海龍各1條)，樣本來(lái)源及其DNA條形碼序列信息詳見(jiàn)表1與表2。

表1 材料來(lái)源及條形碼序列信息

表2 樣品DNA條形碼序列信息

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：N1228)；瓊脂糖粉(法國(guó)biowest公司，批號(hào)：111860)；50×TAE緩沖液(上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：F326KA1304)；DL2000 DNA Marker(批號(hào)：A701D)、10×PCR buffer(批號(hào)：AI60888A)、dNTP Mix(批號(hào)：BL2501E)、r-Taq酶(批號(hào)：AI70714A)均購(gòu)于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

GL323-1SCN多功能精密電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一有限公司)；G8023CSL-2C型微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)；S1000TM Thermal Cycler 基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-rad公司)；Universal Hood III型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)；ND-2000C超微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 DNA提取

根據(jù)海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取10個(gè)太平洋海馬樣品的總DNA，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA模板的純度和濃度。將提取合格的DNA模板置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

利用普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增，COI和ATP6基因擴(kuò)增條件相同。50 μL擴(kuò)增體系中包含5 μL 10×PCR buffer、5 μL dNTP Mix、0.5 μL r-Taq酶、2.5 μL模板DNA、各1 μL上、下游引物、以及35 μL ddH2O。PCR反應(yīng)首先經(jīng)94℃預(yù)變性5 min后，再經(jīng)過(guò)33次94℃變性45 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min的循環(huán)，最后72℃延伸15 min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。將適量瓊脂糖高溫溶解于TAE緩液中，冷卻片刻后加入熒光染料，制成1%瓊脂糖凝膠。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和DNA maker在凝膠中進(jìn)行負(fù)極至正極的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上成像，記錄PCR產(chǎn)物的大小和質(zhì)量，后送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增和測(cè)序所用的PCR引物序列見(jiàn)表3。

表3 PCR引物序列

2.3 數(shù)據(jù)處理與序列分析

將擴(kuò)序成功的DNA序列在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較，即利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析工具，確定序列正反方向。剔除上下游引物序列后，再用Clustal W分析工具進(jìn)行多序列比較，兩兩產(chǎn)生同源性。將序列分析結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)詳見(jiàn)表2。利用MEGA 7.0軟件計(jì)算每條DNA序列的堿基組成，基于K2P雙參數(shù)模型分析堿基變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換/顛換、種內(nèi)及種間遺傳距離等；通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析太平洋海馬與其它海馬之間的親緣關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 性狀特征鑒別

本文在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)地樣本觀察的基礎(chǔ)上[5]，總結(jié)了太平洋海馬干燥體的性狀特征，其典型的鑒別特征包括體型巨大，體表光滑，全身密布白色豎線紋，頰棘長(zhǎng)而明顯，雄性海馬通常有一個(gè)突出龍骨。除此以外，太平洋海馬一般平均體長(zhǎng)13～19 cm，頭冠向后傾斜，眼棘突出，軀干部有6～10個(gè)黑色斑塊，通常具38～40個(gè)尾環(huán)。干燥太平洋海馬性樣本狀特征如圖1所示。

圖1 干燥太平洋海馬樣品典型特征

3.2 太平洋海馬不同條形碼序列分析

本研究通過(guò)對(duì)太平洋海馬樣品的COI和ATP6基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，通過(guò)Mega 7.0軟件對(duì)太平洋海馬內(nèi)兩種基因序列的堿基組成、變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)等進(jìn)行分析，序列分析結(jié)果見(jiàn)表4。在10個(gè)太平洋海馬樣品中，COI序列全長(zhǎng)均為649 bp，GC平均含量為40.71%；ATP6序列長(zhǎng)度為603 bp，GC平均含量占36.58%。此外還發(fā)現(xiàn)，同一條形碼序列中存在不同的單倍型和變異率，其中COI序列存在5種單倍型，ATP6序列存在7種單倍型。COI序列和ATP6序列的變異位點(diǎn)分別為7和12 bp，其序列在種內(nèi)的變異率分別為1.079%和1.990%。

表4 太平洋海馬擴(kuò)增序列分析信息

3.3 太平洋海馬與常見(jiàn)海馬不同序列遺傳距離分析

將太平洋海馬樣品的COI和ATP6序列與其他7種常見(jiàn)海馬樣品的序列進(jìn)行分析，基于K2P參數(shù)模型計(jì)算太平洋海馬的種內(nèi)和種間遺傳距離(圖2)。太平洋海馬種內(nèi)遺傳距離分析結(jié)果顯示，COI序列最大種內(nèi)遺傳距離為0.009 3，平均種內(nèi)遺傳距離為0.002 8，ATP6序列最大和平均種內(nèi)遺傳距離均大于COI序列，分別為0.010 1和0.006 9，提示ATP6基因在太平洋海馬中的進(jìn)化速率較COI更快。太平洋海馬與其它常見(jiàn)海馬的種間遺傳距離分析結(jié)果表明，在COI序列中，太平洋海馬與刺海馬的種間遺傳距離最大，為0.134 9；在ATP6序列中，太平洋海馬與小海馬的遺傳距離最大，為0.183 3。此外，兩個(gè)序列均與大海馬的種間遺傳距離最小，分別為0.027 7和0.059 7，說(shuō)明太平洋海馬可能與大海馬的親緣關(guān)系較近。

A.基于COI序列的種內(nèi)種間遺傳距離 B.基于ATP6序列的種內(nèi)種間遺傳距離

3.4 太平洋海馬與常見(jiàn)海馬NJ樹(shù)聚類(lèi)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證太平洋海馬與其它常見(jiàn)海馬間的親緣關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鄰接法構(gòu)建NJ樹(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，對(duì)COI和ATP6序列的鑒定效率進(jìn)行了分析。圖3-A和3-B結(jié)果表明，由COI序列和ATP6擴(kuò)增所得的太平洋海馬樣品均單獨(dú)聚成一個(gè)大分支，其分支支持率為99%和100%，表明能與其它海馬明顯區(qū)分，后均與大海馬聚為一支，支持率均為100%，結(jié)果與種間距離分析一致，說(shuō)明太平洋海馬與大海馬的親緣關(guān)系最近。在COI序列和ATP6序列所構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹(shù)中，10個(gè)太平洋海馬樣品均能聚集成獨(dú)立大分支，但兩個(gè)大分支中仍存在不同的太平洋海馬小分支，COI序列中存在3個(gè)分支，ATP6序列中存在7個(gè)分支，且支持率均在50%以上。因此，我們猜測(cè)10個(gè)太平洋海馬樣品可能來(lái)自不同的群體，不同群體間太平洋海馬間的差別和遺傳分化可能已達(dá)到亞種的水平。分析結(jié)果也提示了ATP6基因可以作為鑒定海馬藥材不同群體遺傳的DNA條形碼，用于后續(xù)的開(kāi)發(fā)研究。

注：A.基于COI序列的NJ樹(shù)；B.基于ATP6序列的NJ樹(shù)

4 討論

本文對(duì)太平洋海馬的典型性狀特征和經(jīng)典DNA條形碼進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了太平洋海馬形態(tài)鑒別特征包括體型巨大、全身密布白色豎線紋和頰棘長(zhǎng)而明顯等特征，同時(shí)對(duì)太平洋海馬的COI和ATP6序列的種內(nèi)種間變異率、遺傳距離和NJ樹(shù)聚類(lèi)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明這兩種序列均可用于準(zhǔn)確區(qū)分太平洋海馬與其他常見(jiàn)市售海馬，且太平洋海馬與大海馬親緣關(guān)系最近。

中藥鑒定是對(duì)中藥的品種、質(zhì)量進(jìn)行研究，并制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，是中藥研究及擴(kuò)大藥源的基礎(chǔ)和保證。中藥性狀特征的差異應(yīng)追溯到其基因型的差異，即在DNA序列上的差異[7]。DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是近年來(lái)國(guó)際上興起的有關(guān)物種鑒定的新技術(shù)，能夠利用若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA片段對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定[8]。動(dòng)物類(lèi)藥材常選擇核糖體或線粒體中的部分基因作為分子標(biāo)記物，如核糖體中的ITS1和ITS2基因，以及線粒體中的Cyt b、COI、12S rRNA基因[9]，且采用組合條形碼更有利于提高物種鑒定率。本課題組此前已經(jīng)對(duì)包括小海馬、棘海馬等在內(nèi)的多種市售海馬進(jìn)行生藥學(xué)研究[10-11]，驗(yàn)證了COI條形碼可作為海馬藥材分子鑒定的基礎(chǔ)條形碼，ATP6和16S rRNA可作為其補(bǔ)充條形碼，在海馬親緣關(guān)系研究及藥材正偽鑒定中發(fā)揮重要作用。本文選擇了COI和ATP6序列作為太平洋海馬鑒定的DNA條形碼，研究了太平洋海馬中COI和ATP6條形碼的遺傳變異和鑒定效率。通過(guò)遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，太平洋海馬與大海馬的COI和ATP6基因的最小種間遺傳距離分別是其最大種內(nèi)遺傳距離的2.98倍和5.91倍，均未達(dá)到確定物種界限所需的DNA條形碼間隙(barcoding gap)，提示太平洋海馬與大海馬的親緣關(guān)系極近。從文中所構(gòu)建的NJ樹(shù)可以看出，COI和ATP6基因雖然都能夠?qū)⑻窖蠛ｑR從其他不同品種的海馬樣品中區(qū)分，但ATP6序列中的太平洋海馬所形成的分支更穩(wěn)定，提示太平洋海馬樣品可能來(lái)自不同群體。此外，與DNA條形碼相比，線粒體全序列包含更豐富的遺傳信息，在物種的遺傳標(biāo)記、生物地理學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究中被廣泛使用。Zhang[12]等完成了太平洋海馬的線粒體全序列測(cè)定工作，完善了太平洋海馬線粒體基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等信息，為太平洋海馬的進(jìn)一步鑒定與開(kāi)發(fā)保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。與大海馬線粒體基因組全序列比較，兩者基因組結(jié)構(gòu)相似，其序列同源性高達(dá)96.75%，進(jìn)一步證實(shí)了太平洋海馬和大海馬極為相近的親緣關(guān)系。

由于海馬藥材在中醫(yī)藥領(lǐng)域處于重要地位，供需矛盾所造成的過(guò)度開(kāi)發(fā)使野生海馬資源逐漸貧乏，這一現(xiàn)象與早年正品甘草資源衰竭的情況相似。由于正品烏拉爾甘草資源不足，1977年版起《中國(guó)藥典》新增光果甘草和脹果甘草兩種品種，減輕市場(chǎng)用藥需求[13]。一藥多基原對(duì)擴(kuò)大藥源、滿(mǎn)足制藥需要、保障臨床用藥的需要都有一定的促進(jìn)作用。歷版《中國(guó)藥典》對(duì)海馬基原動(dòng)物的記載也有所變動(dòng)，《中國(guó)藥典》1963年版首次確定藥用海馬的基原動(dòng)物為克氏海馬、大海馬、三斑海馬和刺海馬，直至1977年版才新增小海馬，至此藥用海馬的品種再未增加。本文分子鑒定結(jié)果提示，太平洋海馬與藥典正品海馬大海馬親緣關(guān)系最近。太平洋海馬野生資源分布廣泛，其適應(yīng)性較強(qiáng)，在正品海馬資源逐漸匱乏的大背景下，后期應(yīng)加強(qiáng)對(duì)太平洋海馬毒理學(xué)、藥效學(xué)評(píng)價(jià)和化學(xué)組成的基礎(chǔ)研究工作，并與其他正品海馬進(jìn)行比較。在保證太平洋海馬的用藥安全和臨床療效的前提下，時(shí)機(jī)和條件成熟時(shí)可考慮將太平洋海馬納入《中國(guó)藥典》海馬基原項(xiàng)下進(jìn)行管理，在擴(kuò)大海馬藥源，保護(hù)海馬資源的同時(shí)，也能改善海馬藥材市場(chǎng)名字模糊不清、魚(yú)目混珠的現(xiàn)狀，有效維護(hù)海馬藥材的市場(chǎng)秩序。