肖 鵬 呂敏敏 安曉萌 張 霽 司徒偉基 任天華

腸上皮屏障由單層上皮細(xì)胞組成，通過緊密連接結(jié)合在一起。緊密連接由ZO-1、Claudins和Occludin等蛋白質(zhì)介導(dǎo)，是維持腸上皮細(xì)胞屏障所必需的[1]。腸上皮屏障在將腔內(nèi)微生物和抗原分子與內(nèi)環(huán)境隔離的過程中起著至關(guān)重要的作用。腸上皮屏障功能障礙可破壞免疫平衡并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，在炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]。IBD患者的腸上皮屏障功能發(fā)生障礙，腸道通透性增高，表現(xiàn)為緊密連接受損，緊密連接蛋白表達(dá)異常[3]。腸上皮屏障損傷修復(fù)可能是維持IBD患者黏膜愈合的關(guān)鍵[4]。研究表明，腺苷A3受體(A3AR)在IBD患者的腸上皮細(xì)胞中表達(dá)異常[5-6]，并在腸道炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用[7-9]。目前關(guān)于A3AR在腸上皮屏障功能中的作用尚未完全闡明。本研究采用體外方法探討A3AR激動(dòng)劑對(duì)腸上皮屏障的作用，以期為改良IBD的治療方案提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

人結(jié)腸上皮細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、胎牛血清、抗ZO-1特異性抗體、Bis-Tris SDS-PAGE蛋白分離凝膠、胞核蛋白提取試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；A3AR激動(dòng)劑2-Cl-IB-MECA購自英國Tocris公司；重組人TNF-α、磷酸化肌球蛋白輕鏈(p-MLC)、NF-κB p65、GAPDH和抗Histone H3特異性抗體、辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)液均購自美國Cell Signaling公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；總蛋白提取試劑盒購自德國Qiagen公司；FITC-葡聚糖(相對(duì)分子質(zhì)量為4 000)購自美國Sigma-Aldrich公司；肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和抗A3AR特異性抗體均購自美國Abcam公司；Alexa Fluor 488偶聯(lián)的驢抗兔IgG抗體購自美國Jackson ImmunoResearch公司；IL-1β和IL-8的ELISA試劑盒購自美國RayBio公司；Transwell嵌入小室(孔徑4.0 μm)購自美國Corning公司；Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀購自美國Merck MilliPore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將Caco-2細(xì)胞置于添加了20%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2。將不同濃度的(0、1、10、30、100、300、1 000 nmol/L)A3AR激動(dòng)劑2-Cl-IB-MECA加入培養(yǎng)基中預(yù)處理細(xì)胞30 min，使用TNF-α(100 ng/mL)刺激Caco-2細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞和上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將經(jīng)DMEM培養(yǎng)基處理的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，經(jīng)TNF-α處理的細(xì)胞設(shè)為TNF-α組，經(jīng)2-Cl-IB-MECA處理的細(xì)胞設(shè)為2-Cl-IB-MECA組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.2 體外腸上皮屏障功能障礙的誘導(dǎo)和檢測(cè) 為了探究2-Cl-IB-MECA對(duì)腸上皮屏障功能的影響，本研究使用TNF-α作用于Caco-2細(xì)胞單層，誘導(dǎo)腸上皮屏障功能障礙，然后分析經(jīng)2-Cl-IB-MECA處理后細(xì)胞的跨上皮細(xì)胞電阻值(TEER)和細(xì)胞旁通透性(FITC-葡聚糖通量)變化。將Caco-2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于Transwell嵌入小室的頂側(cè)室，培養(yǎng)至少2周。使用Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀測(cè)量TEER，評(píng)估細(xì)胞單層的完整性，以確保獲得TEER絕對(duì)值>500 Ω/cm2的功能性上皮單細(xì)胞層，這表明已形成完整的上皮屏障。將100 nmol/L的2-Cl-IB-MECA加入Caco-2細(xì)胞單層的頂側(cè)室進(jìn)行預(yù)處理30 min，然后將100 ng/mL的TNF-α加入Caco-2細(xì)胞單層的基側(cè)室進(jìn)行孵育，以誘導(dǎo)腸上皮屏障功能障礙。TNF-α處理48 h后檢測(cè)TEER。隨后，檢測(cè)細(xì)胞單層的通透性，具體步驟：將1 mg/mL的FITC-葡聚糖加入細(xì)胞頂側(cè)室并孵育2 h后，將基側(cè)室溶液收集至96孔板中，使用Synergy H2微板閱讀器在激發(fā)波長490 nm和發(fā)射波長520 nm下分別測(cè)定FITC-葡聚糖的濃度，通過計(jì)算FITC-葡聚糖從頂側(cè)室到基側(cè)室的轉(zhuǎn)運(yùn)來測(cè)量細(xì)胞旁通透性。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率 采用CCK-8法評(píng)估2-Cl-IB-MECA 對(duì)Caco-2細(xì)胞存活的影響。將Caco-2細(xì)胞以5 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，在添加了20%胎牛血清、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入不同濃度的2-Cl-IB-MECA，再孵育48 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL毒性檢測(cè)液的CCK-8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為450 nm的OD值。

1.2.4 ELISA實(shí)驗(yàn) 按照ELISA試劑盒說明書，測(cè)定基底外側(cè)培養(yǎng)液中IL-1β和IL-8的表達(dá)水平。

1.2.5 免疫熒光法 采用免疫熒光法檢測(cè)ZO-1的表達(dá)水平。將培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，用含有0.1% Triton X-100和5%正常驢血清的PBS溶液孵育30 min，加入抗ZO-1抗體于4 ℃孵育過夜，再加入Alexa Fluor 488偶聯(lián)的驢抗兔IgG抗體于室溫避光孵育1 h，最后用含有DAPI和防熒光淬滅的封片劑封片。使用熒光顯微鏡捕獲圖像并進(jìn)行免疫熒光分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ZO-1、NF-κB p65、MLCK和p-MLC的蛋白表達(dá)水平。將Caco-2細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，添加100 nmol/L 2-Cl-IB-MECA 預(yù)處理30 min，再用重組人TNF-α(100 ng/mL)分別處理6 h(用于檢測(cè)NF-κB p65、MLCK和p-MLC)或48 h(用于檢測(cè)ZO-1)。然后將細(xì)胞溶解在蛋白提取試劑盒中的裂解緩沖液中，在4 ℃下以離心力15 000 g離心10 min，除去細(xì)胞碎片，吸取上清液獲得蛋白樣本。采用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。每個(gè)蛋白樣品取樣30 μg，95 ℃ 5 min變性，在10%梯度的Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。在4 ℃下與不同的一抗(抗ZO-1、NF-κB p65、MLCK和p-MLC抗體)孵育過夜。以GAPDH作為總蛋白內(nèi)參，以Histone H3作為核蛋白內(nèi)參。用1∶1 000 HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG二抗于室溫孵育1 h。使用ECL液進(jìn)行顯像。使用Bio-Rad成像系統(tǒng)拍攝蛋白質(zhì)印跡條帶。應(yīng)用Quantity One軟件定量分析蛋白質(zhì)印跡條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2-Cl-IB-MECA對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果指出，各濃度(0、1、10、30、100、300、1 000 nmol/L)2-Cl-IB-MECA組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。這提示1 000 nmol/L以下濃度的2-Cl-IB-MECA對(duì)Caco-2細(xì)胞的活性沒有影響。見圖1。

圖1 不同濃度2-Cl-IB-MECA 預(yù)處理后Caco-2細(xì)胞的存活率

2.2 2-Cl-IB-MECA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障功能障礙的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，TNF-α組Caco-2細(xì)胞單層的TEER顯著降低，F(xiàn)ITC-葡聚糖通量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與TNF-α組相比，30 nmol/L和100 nmol/L 2-Cl-IB-MECA組的TEER均顯著升高，F(xiàn)ITC-葡聚糖通量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)果還顯示，隨著2-Cl-IB-MECA濃度升高，上述效應(yīng)也隨之增強(qiáng)。

表1 各組TEER和FITC-葡聚糖通量的比較

2.3 2-Cl-IB-MECA 對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞IL-1β和IL-8水平的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，TNF-α組的IL-1β和IL-8表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。與TNF-α組相比，100 nmol/L 2-Cl-IB-MECA組(下文簡(jiǎn)稱2-Cl-IB-MECA組)的IL-1β和IL-8表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表2 各組IL-1β和IL-8表達(dá)水平的比較

2.4 2-Cl-IB-MECA對(duì)Caco-2細(xì)胞ZO-1的表達(dá)水平和分布的影響

TNF-α組ZO-1的相對(duì)表達(dá)量為0.06±0.01，低于對(duì)照組(0.17±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2-Cl-IB-MECA組ZO-1的相對(duì)表達(dá)量為0.12±0.02，高于TNF-α組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組Caco-2細(xì)胞ZO-1的蛋白質(zhì)印跡條帶

如圖3所示，對(duì)照組的ZO-1沿細(xì)胞邊緣定位，呈網(wǎng)格狀分布。經(jīng)TNF-α處理48 h后，ZO-1的分布變得不規(guī)則和不連續(xù)。經(jīng)2-Cl-IB-MECA處理后，ZO-1的破壞情況得到改善。

圖3 各組Caco-2細(xì)胞ZO-1的分布 免疫熒光 ×400 A 對(duì)照組 B TNF-α組 C 2-Cl-IB-MECA組

2.5 2-Cl-IB-MECA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65、MLCK和p-MLC表達(dá)水平的影響

如表3、圖4所示，與對(duì)照組相比，TNF-α組NF-κB p65、MLCK和p-MLC的表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。與TNF-α組相比，2-Cl-IB-MECA組NF-κB p65、MLCK和p-MLC的表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表3 各組NF-κB p65、MLCK和p-MLC相對(duì)表達(dá)量的比較

圖4 各組Caco-2細(xì)胞NF-κB p65、MLCK和p-MLC的蛋白質(zhì)印跡條帶 A NF-κB p65蛋白 B MLCK和p-MLC蛋白

3 討論

IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是一種慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎性疾病，腸上皮屏障功能障礙是其重要特征[2]。機(jī)體腸上皮屏障功能障礙，緊密連接的破壞在IBD發(fā)病中起重要作用。腸上皮細(xì)胞表達(dá)緊密連接蛋白，包括ZO-1、Claudins和Occludin等，形成一種天然的腸道屏障，阻止微生物抗原和毒素滲透至黏膜固有層。緊密連接的破壞可導(dǎo)致腸上皮屏障功能障礙[10]。研究表明，IBD患者腸上皮細(xì)胞緊密連接的完整性受損，活動(dòng)期患者結(jié)腸黏膜ZO-1的表達(dá)水平較健康對(duì)照者顯著降低[11]。TNF-α誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達(dá)降低可導(dǎo)致IBD患者腸上皮屏障功能障礙[12]。此外，在體外通過使用TNF-α刺激Caco-2細(xì)胞單層來模擬屏障受損，會(huì)導(dǎo)致ZO-1表達(dá)下調(diào)[11]。本研究構(gòu)建了TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞單層屏障損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α組的TEER降低，細(xì)胞旁通透性增高，ZO-1的表達(dá)水平降低且形態(tài)被破壞，這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相符[11,13]，表明腸上皮屏障損傷模型構(gòu)建成功。

研究表明，A3AR在活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平降低[5-6]，A3AR激動(dòng)劑2-Cl-IB-MECA在體內(nèi)可減輕小鼠腸道的炎性反應(yīng)[7-8]，在體外可抑制人腸上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-Cl-IB-MECA可改善TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2單層細(xì)胞中TEER下降和細(xì)胞旁通透性增高情況，同時(shí)可以升高ZO-1蛋白的表達(dá)水平，改善ZO-1蛋白的分布情況。這提示A3AR的激活可調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞ZO-1的表達(dá)，減輕TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2單層細(xì)胞屏障的損傷。

NF-κB的激活介導(dǎo)了TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)和腸上皮通透性增高[14]，并有助于MLCK的表達(dá)上調(diào)[13-14]。研究表明，MLCK可介導(dǎo)肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化，在促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的腸上皮屏障破壞中起關(guān)鍵作用[15]。此外，A3AR激動(dòng)劑可抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)[9]。本研究結(jié)果顯示，2-Cl-IB-MECA可抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞NF-κB p65、MLCK和p-MLC的表達(dá)，這提示2-Cl-IB-MECA可能通過抑制NF-κB和MLCK的活化，以及隨后的MLC磷酸化來減輕TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞單層屏障功能障礙。

在腸道炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中，NF-κB的激活參與了IL-6等促炎細(xì)胞因子信號(hào)通路表達(dá)，導(dǎo)致腸上皮屏障的完整性受損，黏膜免疫應(yīng)答增強(qiáng)[16]。本研究結(jié)果表明，2-Cl-IB-MECA可抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-8的分泌。這提示A3AR激活可能通過抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，從而調(diào)節(jié)IBD的發(fā)生和發(fā)展。一項(xiàng)結(jié)腸炎小鼠模型研究結(jié)果指出，A3AR激動(dòng)劑可減輕結(jié)腸黏膜組織的炎性反應(yīng)，降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，從而抑制結(jié)腸炎的發(fā)展[7]，這與本研究的結(jié)論相符。

綜上所述，A3AR激活可調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞單層的緊密連接蛋白的表達(dá)和分布，改善腸上皮屏障功能障礙，其分子機(jī)制可能是通過抑制NF-κB/MLCK/p-MLC信號(hào)通路的表達(dá)。A3AR對(duì)腸道屏障功能的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究，A3AR可能為IBD的治療提供新的途徑。