薛 麗 葉 明 王 剛

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是食管癌的主要亞型，在中國(guó)的發(fā)病率較高[1]。目前ESCC的臨床診斷和治療方法已取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步，但ESCC患者的5年生存率仍低于15%[2]。因此，迫切需要探究ESCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。研究表明，ESCC細(xì)胞易于侵襲周?chē)M織，從而難以進(jìn)行完整的手術(shù)切除，容易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致ESCC患者的生存率較低[3]。從生物學(xué)的角度來(lái)看，ESCC細(xì)胞的侵襲是基于與其他腫瘤或非腫瘤細(xì)胞，以及食管上皮細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用。

基質(zhì)Gla蛋白(MGP)是一種細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白和ECM相關(guān)蛋白，最初從骨組織中分離而來(lái)，表達(dá)于腎、肺、心、軟骨和血管平滑肌細(xì)胞中[4]。MGP蛋白含有79個(gè)氨基酸，包含因維生素K依賴(lài)的羧化作用而產(chǎn)生的翻譯后修飾的γ-羧基谷氨酸殘基。研究表明MGP參與了抑制動(dòng)脈和軟骨的鈣化過(guò)程[5]，并且MGP的種系突變會(huì)引發(fā)Keutel綜合征，從而導(dǎo)致異位鈣化異常和面部發(fā)育不全[6]。目前關(guān)于MGP表達(dá)水平與ESCC進(jìn)展相關(guān)的機(jī)制的研究報(bào)道較少。MGP已被證明可促進(jìn)胃癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，并且在多種人類(lèi)腫瘤(包括乳腺癌、膠質(zhì)瘤、胃癌)中均發(fā)現(xiàn)MGP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變與腫瘤的侵襲及患者預(yù)后相關(guān)[7-9]。由此推測(cè)，MGP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)失調(diào)與ESCC細(xì)胞的侵襲可能有關(guān)。本研究觀(guān)察了ESCC組織中MGP的表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化，并分析了MGP對(duì)ESCC細(xì)胞侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2014年5月至2019年5月于中國(guó)人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院腫瘤科接受手術(shù)治療的253例ESCC患者的ESCC組織標(biāo)本和癌旁非癌組織(距離腫瘤邊緣2～3 cm的健康組織)標(biāo)本，分別設(shè)為ESCC組和癌旁非癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)2013年中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)食管癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)發(fā)布的《食管癌規(guī)范化診治指南》確診為ESCC[10]；(2)術(shù)前未進(jìn)行放射治療或化學(xué)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)食管腺癌患者；(2)非原發(fā)ESCC，腫瘤轉(zhuǎn)移至食管的患者；(3)其他國(guó)家和民族的患者。采用隨機(jī)數(shù)字表法從253例患者中選擇經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time qPCR)法驗(yàn)證ESCC組織中MGP基因表達(dá)水平高于癌旁非癌組織的5例患者，收集其ESCC組織標(biāo)本和癌旁非癌組織標(biāo)本，按收集順序編號(hào)為1～5號(hào)，將這5例患者的ESCC組織標(biāo)本設(shè)為A組，將相匹配的癌旁非癌組織標(biāo)本設(shè)為B組，檢測(cè)兩組MGP的蛋白表達(dá)水平和分布。收集所有入選患者的年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、TNM分期[美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)發(fā)布的食管癌第八版分期標(biāo)準(zhǔn)][11]、淋巴結(jié)狀態(tài)、浸潤(rùn)程度等臨床資料。所有患者均知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)986-2019041204)。

1.2 試劑與耗材

人ESCC細(xì)胞系KYSE30購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；Real-time qPCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MGP一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的沉默質(zhì)粒(si-DNMT1)和陰性對(duì)照(si-NC)、MGP的重組高表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-MGP)和其空載體(EV)均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)公司。

1.3 MGP mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

采用Real-time qPCR法檢測(cè)組織中MGP的表達(dá)水平。采用TRIzol一步法提取253例組織樣本(包括ESCC組和癌旁非癌組)及KYSE30細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性360 s，之后96 ℃變性10 s，55 ℃退火25 s，71 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為38。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2次。以2-△△Ct表示MGPmRNA的相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量的判定標(biāo)準(zhǔn)：log2FC>1為高表達(dá)，log2FC<-1為低表達(dá)，其中FC指兩組表達(dá)量的比值。

表1 引物序列

1.4 MGP啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)

提取ESCC組和癌旁非癌組中的DNA，使用HhaI和McrBC酶切每組的DNA樣品，并以非酶切樣本作為對(duì)照。具體步驟：包含1 μg DNA樣本和60 U限制性?xún)?nèi)切酶且總體積為100 μL的體系，在37 ℃下反應(yīng)16 h，添加10 U限制酶反應(yīng)5 h。使用德國(guó)Qiagen PCR純化系統(tǒng)對(duì)經(jīng)HhaI和McrBC消化的DNA樣本進(jìn)行純化。MGP甲基化判斷：(1)無(wú)甲基化，指經(jīng)McrBC消化的DNA中有擴(kuò)增，但經(jīng)HhaI消化的DNA中無(wú)擴(kuò)增；(2)不完全甲基化，指每個(gè)等位基因均包含甲基化和未甲基化區(qū)域，導(dǎo)致HhaI和McrBC消化，但無(wú)后續(xù)擴(kuò)增；(3)完全甲基化，指經(jīng)HhaI消化的DNA中有擴(kuò)增，但無(wú)來(lái)自McrBC消化的DNA。定量PCR反應(yīng)條件同1.3小節(jié)。甲基化率=C/(C+T)×100%，其中C指胞嘧啶，T指胸腺嘧啶。甲基化率的判定標(biāo)準(zhǔn)：log2FC>1為高甲基化水平，log2FC<-1為低甲基化水平，其中FC指兩組甲基化率的比值。

1.5 DNA亞硫酸氫鹽修飾及測(cè)序

使用亞硫酸氫鹽對(duì)ESCC組和癌旁非癌組的基因組DNA進(jìn)行處理，甲基化亞硫酸氫鹽測(cè)序試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的MGP基因啟動(dòng)子區(qū)DNA進(jìn)行測(cè)序。MGP引物序列：正向?yàn)?′-TGCGTCAGTCTTATGCTAAGCA-3′，反向?yàn)?′-TTGCACAGTGCATCGACCACGT-3′。樣品均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 MGP蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MGP的蛋白水平。取1～5號(hào)患者的ESCC組織標(biāo)本和癌旁非癌組織標(biāo)本，在冰浴中研磨，使用磷酸鹽緩沖液清洗后加入裂解液。采用Bio-Rad蛋白測(cè)定法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將10 mg總蛋白上樣至4%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，并進(jìn)行電泳。將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，并用MGP一抗(1∶500)和GAPDH一抗(1∶2 000)孵育轉(zhuǎn)印有蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜；以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。兩種一抗均在4 ℃下孵育8 h。使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)連接的抗兔IgG二抗(1∶4 000)室溫孵育45 min。使用Luminol溶液顯影，應(yīng)用ImageJ v1.8.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 MGP蛋白的定位和分布檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)染色法評(píng)估MGP蛋白在組織中的定位和分布。取1～5號(hào)患者的ESCC組織標(biāo)本和癌旁非癌組織標(biāo)本，切成4 μm厚度的組織薄片。將切片于二甲苯溶液及乙醇梯度溶液中脫蠟、脫水后，使用3% H2O2處理，隨后在微波爐中使用枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。使用5%山羊血清封閉，加入稀釋后的MGP一抗(1∶400)和Ki67(1∶500，作為陽(yáng)性對(duì)照)，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜。滴加生物素偶聯(lián)二抗，室溫放置30 min。緩沖液清洗后，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB工作液顯色。用自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，中性樹(shù)脂封片。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞被標(biāo)記為黃色、棕黃色、黃褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性率=目標(biāo)區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/目標(biāo)區(qū)域總細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在含5% CO2的恒溫(37 ℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)KYSE30細(xì)胞。將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中。分別使用si-DNMT1、si-NC、pcDNA3.1-MGP和EV對(duì)KYSE30細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)間為24 h，分別設(shè)為si-DNMT1組、si-NC組、MGP過(guò)表達(dá)組和EV組，另外將不進(jìn)行任何處理的KYSE30細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。

1.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

使用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠并混合，將稀釋后的基質(zhì)膠均勻涂抹于Transwell上室，然后置于24孔底部腔室中。底部腔室有250 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將si-DNMT1組、si-NC組、MGP過(guò)表達(dá)組、EV組和對(duì)照組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于Transwell上室中。孵育24 h后，分別使用甲醇和0.1%的結(jié)晶紫固定侵襲的細(xì)胞。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞的數(shù)量。相對(duì)細(xì)胞數(shù)量=各處理組細(xì)胞數(shù)量平均值/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ESCC患者的一般資料

253例ESCC患者中，男性158例，女性95例；年齡43～78歲，年齡中位數(shù)為65歲。按照解剖學(xué)部位劃分，腫瘤位于食管中段有210例，位于上、下段有43例。腫瘤直徑<4 cm 107例，≥4 cm 146例。根據(jù)組織病理學(xué)分級(jí)，高分化43例，中分化196例，低分化14例。按照侵襲程度劃分，T1～T2期59例，T3～T4期194例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移124例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移129例。根據(jù)AJCC第七版的分期標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤Ⅰ期18例，Ⅱ期72例，Ⅲ期163例。

2.2 MGP mRNA的相對(duì)表達(dá)量

采用Real-time qPCR法檢測(cè)ESCC組和癌旁非癌組中MGP基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與癌旁非癌組相比，ESCC組中MGPmRNA的相對(duì)表達(dá)量較高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。由圖1B可知，166例(65.6%)患者的ESCC組織中MGPmRNA的相對(duì)表達(dá)量高于與之配對(duì)的癌旁非癌組織(|log2FC|>1，P<0.05)。

注：與癌旁非癌組相比，*P<0.05

2.3 MGP蛋白的表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，A組中MGP的蛋白表達(dá)水平高于B組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A組指5例患者的ESCC組織標(biāo)本，B組指該5例患者的癌旁非癌組織標(biāo)本

MGP的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖3A、圖3B所示，B組中MGP的陽(yáng)性率高于A(yíng)組。 以Ki67基因作為陽(yáng)性對(duì)照，其在ESCC組和癌旁非癌組中的表達(dá)見(jiàn)圖3C、圖3D。

圖3 MGP在ESCC組和癌旁非癌組中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色 A ESCC組中MGP的表達(dá) 左×40 右×400 B 癌旁非癌組中MGP的表達(dá) 左×40 右×400 C ESCC組中Ki67的表達(dá) ×40 選區(qū)×400 D 癌旁非癌組中Ki67的表達(dá) ×40 選區(qū)×400

2.4 MGP啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平

甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，253例患者M(jìn)GP基因低甲基化的有180例。ESCC組中MGP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島平均甲基化率為(10.07±5.29)%，低于癌旁非癌組(17.92±3.49)%，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.15，P=0.025)。見(jiàn)圖4A。

ESCC組和癌旁非癌組使用亞硫酸氫鹽修飾DNA后，采用Real-time qPCR法擴(kuò)增MGP基因的啟動(dòng)子區(qū)域。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，兩組PCR產(chǎn)物的特異性條帶長(zhǎng)度均為243 bp(見(jiàn)圖4B)，與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并比對(duì)測(cè)序結(jié)果與MGP基因啟動(dòng)子區(qū)的原始序列。結(jié)果顯示，癌旁非癌組中MGP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化且未被亞硫酸氫鹽所修飾，而ESCC組中MGP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)呈低甲基化水平。

2.5 MGP過(guò)表達(dá)對(duì)于ESCC細(xì)胞侵襲能力的影響

如圖5所示，與EV組及對(duì)照組相比，MGP過(guò)表達(dá)組的侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.610，P=0.027；t=6.223，P=0.018)；而對(duì)照組與EV組的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明MGP過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲能力。

2.6 敲低DNMT1對(duì)于ESCC細(xì)胞侵襲能力的影響

如圖6所示，與si-NC組和對(duì)照組相比，si-DNMT1組的侵襲細(xì)胞數(shù)量均顯著增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.551，P=0.004；t=7.119，P=0.012)。對(duì)照組與si-NC組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明敲低DNMT1能增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲能力。

注：與EV組比較，a P<0.05

注：與si-NC組比較，a P<0.05

3 討論

惡性腫瘤是表觀(guān)遺傳疾病。表觀(guān)遺傳的變化可能導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默。在人類(lèi)基因組中，CpG二核苷酸分布不協(xié)調(diào)形成的富含CpG的區(qū)域稱(chēng)為CpG島。CpG島異常甲基化是常見(jiàn)的表觀(guān)遺傳修飾，可影響細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的多種信號(hào)通路，例如細(xì)胞凋亡和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等。本研究結(jié)果顯示，人ESCC組織中的MGP甲基化狀態(tài)異常，MGP的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的調(diào)控，且MGP可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的侵襲。

本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC患者的腫瘤組織中MGP表達(dá)普遍上調(diào)，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和免疫組織化學(xué)染色法證實(shí)了該結(jié)果。有研究報(bào)道，胃癌組織中MGP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高[9]。MGP是一種細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白，在胞外廣泛表達(dá)[9]，在胃癌細(xì)胞內(nèi)亦存在MGP積累[12]。研究表明，MGP可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)的新型轉(zhuǎn)錄共激活因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[8-9]。本研究表明，MGP過(guò)表達(dá)能顯著增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路的激活可促進(jìn)MGP表達(dá)[13]，該通路與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，并可能通過(guò)MGP發(fā)揮作用[14]。另有研究指出，MGP是多種腫瘤(包括胃癌、膠質(zhì)瘤等)的潛在治療靶點(diǎn)[9,15]。因此，MGP在ESCC中高表達(dá)可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力，從而促進(jìn)ESCC的進(jìn)展。

MGP甲基化改變?cè)诮Y(jié)直腸癌的發(fā)展中扮演著重要角色[16]。本文探究了MGP的表觀(guān)遺傳調(diào)控功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGP在人ESCC組織中表達(dá)水平較高，但其甲基化水平較低，且MGP的高表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控。以上結(jié)果提示MGP的低甲基化和高表達(dá)可作為ESCC早期診斷的標(biāo)志物。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明，MPG過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲能力，而敲低DNMT1同樣可以增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的侵襲能力，這提示MGP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化改變可促進(jìn)ESCC的進(jìn)展，因此MGP甲基化有望作為ESCC的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，MGP在ESCC組織中高表達(dá)，MGP表達(dá)水平和甲基化水平的改變是調(diào)控ESCC進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制之一。本課題組今后將進(jìn)一步擴(kuò)大觀(guān)察樣本，在體內(nèi)分析MGP的表達(dá)和甲基化水平與ESCC患者生存率的相關(guān)性，深入探究MGP對(duì)ESCC的調(diào)控機(jī)制。