閆鳳娟 周 琳 周海蓉

潰瘍性結腸炎(UC)是一種病情反復發(fā)作、病程遷延不愈的難治性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。自身免疫反應可能在遺傳易感性、微生物感染和環(huán)境損害的致病性相互作用中發(fā)揮著核心作用。UC的治療方法包括藥物、手術及對癥支持治療等，目前干細胞移植用于UC治療是國內外相關領域研究的熱點。有研究探討骨髓間充質干細胞在小鼠遠端結腸的定位情況，為干細胞移植治療UC的實驗研究提供了理論基礎[1]。毛囊中含有多種干細胞，包括角朊干細胞、間充質干細胞、黑色素干細胞等，其中毛囊間充質干細胞(HF-MSC)是一種多潛能干細胞，能自我更新，并且具有成骨、成軟骨及成脂的分化潛能，還具有強大的增殖能力和可塑性。本實驗通過分離大鼠胡須部皮膚的毛囊獲取HF-MSC，采用尾靜脈注射的方法移植HF-MSC，觀察其對UC大鼠模型的治療效果并分析可能的機制，為HF-MSC移植治療UC提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取1周齡SD雄性大鼠4只，體質量21～26 g，以及4周齡SD雄性大鼠25只，體質量100～150 g，均購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)于SPF級室內(20～21 ℃，60%濕度，12 h晝夜循環(huán))，所有操作均遵守動物倫理法。葡聚糖硫酸鈉(DSS)購自源葉生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素及胰酶均購自上海碧云天生物技術有限公司；Ⅳ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich公司；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)購自北京義翹神州生物技術有限公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司；熒光標記抗體PE-CD44、PE-CD31均購自美國R&D公司，FITC-CD90購自北京Biolegend公司，Cy3-CD34購自愛必信生物科技有限公司；流式抗體CD90、CD44、CD31、CD45均購自美國BD公司；免疫組織化學抗體Musashi-1、CDX2均購自美國Santa Cruz公司，PCNA購自英國Abcamgsi公司。

1.2 方法

1.2.1 HF-MSC的分離培養(yǎng)、擴增、鑒定 選取毛囊處于生長期的1周齡SD雄性大鼠，75%乙醇溶液消毒，剪取胡須部皮膚，剪碎成0.4×0.4 cm組織塊，加入0.1%Ⅳ型膠原酶中，37 ℃消化2 h或4 ℃ 消化過夜。在顯微鏡下用1 mL注射器針頭從結締組織鞘中分離出毛囊，接種到24孔板內，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗及bFGF、EGF的細胞培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長匯合度達到70%～80%時，進行消化、計數、傳代至6孔板中生長。以此循環(huán)進行傳代，收集大量P3代細胞，分別應用PE-CD44、PE-CD31、FITC-CD90、Cy3-CD34抗體進行細胞免疫熒光鑒定，同時分別應用CD90、CD44、CD31、CD45抗體4 ℃孵育60 min，使用流式細胞儀鑒定。鑒定成功后，制備1×106/mL HF-MSC懸液。

1.2.2 UC大鼠模型的構建和評估 選取4周齡SD雄性大鼠25只，隨機分為對照組5只，模型組20只。對照組給予正常飲食；模型組于造模前禁食24 h，不禁飲，造模期間給予正常飲食。造模方法為每日用5 mL注射器連接14號針頭，抽取10% DSS溶液灌胃(3.5 mL/100 g)，連續(xù)灌胃7 d；考慮到大鼠胃容量較小，每次灌注量<5 mL，如≥5 mL應分次灌胃，每次間隔4 h。

造模期間，每日觀察大鼠的狀態(tài)、體質量、大便性狀，并觀察是否有便血。根據 Murano等[2]建立的評分系統(tǒng)，以體質量、大便性狀和大便出血等情況評價UC大鼠模型的疾病活動指數(DAI)：(1)無體質量下降、大便性狀正常、無便血為0分；(2)體質量下降1%～5%為1分；(3)體質量下降5%～10%、半稀便、大便隱血(+)為2分；(4)體質量下降10%～15%、腹瀉、大便隱血(+)為3分；(5)體質量下降>15%、腹瀉、便血為4分。連續(xù)灌胃7 d后，在深麻醉下以頸椎脫臼法處死對照組、模型組大鼠各2只，留取整條結腸，以PBS沖洗。觀察兩組的結腸大體標本，測量長度，結腸組織用1%伊文思藍染色液染色?？v行剖開新鮮的大鼠結腸，取炎性潰瘍等病變處結腸組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、H-E染色，在顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化，評估UC模型是否構建成功。

1.2.3 HF-MSC移植 造模完成后次日，將模型組大鼠隨機分為HF-MSC組和NaCl組，每組10只。HF-MSC組給予尾靜脈注射制備好的1×106/mL HF-MSC懸液1 mL，NaCl組給予經尾靜脈注射0.9%NaCl溶液1 mL，每周注射3次(周一、周四、周日注射)，共注射2周。對照組未予任何處理。緩慢注射完成后，按壓注射部位1～2 min，防止出血及注射液滲出。在此期間，觀察各組大鼠的活動、體質量、大便性狀、大便出血等情況的變化，計算DAI評分。

1.2.4 免疫組織化學法檢測Musashi-1、增殖細胞核抗原、尾型同源盒轉錄因子2的表達 注射2周后，次日在深麻醉下以頸椎脫臼法處死各組大鼠，取結腸組織制作病理切片。免疫組織化學檢測采用SP二步法，Musashi-1工作濃度為1∶100，增殖細胞核抗原(PCNA)、尾型同源盒轉錄因子2(CDX2)工作濃度均為1∶200，具體步驟參見試劑盒說明書，在顯微鏡下觀察Musashi-1、PCNA、CDX2蛋白的表達情況，隨后使用ImageJ軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 HF-MSC的培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 HF-MSC的培養(yǎng) 將HF-MSC接種于24孔培養(yǎng)板，約2 d后可觀察到毛囊周圍有細胞爬出的趨勢，尤其是乳突部，增加培養(yǎng)液，約7 d后，長梭形細胞逐漸密集，與MSC形態(tài)相似，呈魚群、漩渦狀分布。待細胞生長匯合度達70%～80%，經胰酶消化傳代至6孔板，傳代后的細胞仍保持良好的形態(tài)，生長迅速、貼壁快，24 h可以全部貼壁，呈均勻分布，約3 d可以融合生長為單層。持續(xù)傳代至P3代細胞備用。

2.1.2 細胞免疫熒光鑒定 取P3代細胞進行表面抗原鑒定，細胞免疫熒光染色顯示HF-MSC表面標志物CD44、CD90呈高表達，即熒光顯微鏡視野下PE標記的CD44在細胞膜出現紅色熒光，FITC標記的CD90在細胞膜出現綠色熒光，細胞核由DAPI染為藍色。細胞膜表面CD31、CD34呈低表達或不表達，即PE標記的CD31、Cy3標記的CD34在細胞膜無熒光，只顯示藍色細胞核。見圖1。

圖1 HF-MSC表面標志物的免疫熒光鑒定 ×20 A CD31低表達或不表達(無熒光) B CD34低表達或不表達(無熒光) C CD44高表達(紅色熒光) D CD90高表達(綠色熒光)

2.1.3 流式細胞術鑒定 流式細胞術檢測結果顯示，HF-MSC高表達MSC特異性表面標志物CD90、CD44，陽性率分別為98%、78% ，而基本不表達或低表達內皮細胞標志物CD31和造血干細胞標志物CD45，陽性率分別為4%、1%。見圖2。

圖2 流式細胞術分析擴增的HF-MSC A CD44和CD90均呈高表達 B CD31和CD45均呈低表達 C CD90呈高表達，CD45呈低表達 D CD44呈高表達，CD31呈低表達

2.2 UC大鼠模型的評估

建模7 d后，對照組大鼠飲食、活動及大便性狀正常。模型組大鼠造模后出現厭食、活動減少、便血或大便隱血(+～+ +)、體質量降低。模型組的DAI評分較對照組明顯升高(3.25分比0.25分)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3A。使用1%伊文思藍染色液染色，模型組的結腸病變嚴重部位呈淡藍色，對照組呈粉紅色。測量兩組的結腸長度，模型組結腸較對照組明顯縮短，見圖3B。顯微鏡下觀察結腸H-E染色切片，模型組結腸黏膜萎縮，腸絨毛破壞，腸上皮細胞缺失，黏膜及黏膜下層可見密集分布的淋巴細胞和單核細胞浸潤，對照組則顯示完整的腸黏膜和絨毛，見圖4。

圖3 對照組和模型組的DAI評分及結腸大體形態(tài)比較 A 兩組的DAI評分 B 兩組的結腸大體形態(tài)及模型組大鼠腹腔圖像

圖4 UC大鼠模型的結腸組織病理圖像 H-E染色 ×20 A 對照組 B 模型組

2.3 HF-MSC移植的治療效果

大鼠尾靜脈注射HF-MSC懸液2周后，次日分析數據。免疫組織化學結果表明，HF-MSC組的Musashi-1、PCNA、CDX2蛋白表達水平均較對照組、NaCl組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見圖5、圖6。與NaCl組相比，HF-MSC組大鼠狀態(tài)逐漸好轉，體質量不再驟降，大便出血情況也逐漸好轉， DAI評分明顯降低(1.1分比2.9分)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與NaCl組相比，HF-MSC組的DAI評分更接近于對照組(0.25分)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；見圖7。

圖5 3組大鼠結腸組織中Musashi-1、PCNA、CDX2表達水平的比較 免疫組織化學染色 ×20

圖6 各組大鼠結腸組織中Musashi-1、PCNA、CDX2表達水平的半定量分析 ×20 A Musashi-1 B PCNA C CDX2

圖7 HF-MSC組經HF-MSC移植后DAI評分與另兩組的比較

3 討論

MSC可從各類組織中分離得到，雖然從毛囊培養(yǎng)出MSC的數量相對較少，但選擇切取大鼠胡須部皮膚提取HF-MSC對供體的傷害較小[3]。HF-MSC的體外擴增是進行細胞移植前的必需步驟。本研究中大量擴增的HF-MSC高表達CD44和CD90，但低表達或不表達CD31、CD34和CD45，該結果符合國際細胞治療學會定義的MSC標準。

本研究用DSS處理的大鼠表現出結腸組織受損的大體形態(tài)變化及UC的腸道癥狀。UC大鼠模型的結腸病理改變也較明顯，這與既往關于嚙齒動物中DSS誘導的UC模型的表現相符[4-6]。HF-MSC移植可明顯減輕DSS誘導的UC大鼠的癥狀，表現為體質量、大便性狀、大便出血情況的變化被緩解，這些結果證實了HF-MSC移植對UC大鼠模型具有治療作用。推測其機制可能是通過促進Musashi-1、PCNA、CDX2蛋白表達協同發(fā)揮作用，進而重建腸上皮的屏障功能，改善UC大鼠的腸道癥狀。

腸道干細胞的標志物有很多，包括Musashi-1、Hes-1、CDX2、Lgr5、Bim-1等，其中Musashi-1為翻譯抑制因子并可調節(jié)Notch信號轉導，從而調節(jié)Hes-1的表達，Hes-1是分泌譜系(杯狀細胞、腸內分泌細胞和Paneth細胞)分化所必需的因子[7]。在腸道中，CDX2是一種上皮功能相關基因調控必不可少的腸道特異性轉錄因子，參與維持上皮內穩(wěn)態(tài)[8-9]，并可調控許多下游基因的表達，具有修復炎性損傷的作用[10]。目前關于CDX2與腸道炎性反應關系的研究較少，研究顯示UC腸上皮細胞的CDX2表達水平顯著降低[11]。

本研究沒有關注HF-MSC對于UC大鼠模型的潛在免疫抑制和抗炎作用，而是追蹤移植的HF-MSC在病變腸道中的歸巢和分化。與NaCl組相比，HF-MSC組高表達PCNA，表明HF-MSC在腸道中進行了增殖。此外，HF-MSC注射移植兩周后高表達CDX2、Musashi-1。Musashi-1是一種RNA結合蛋白，已被證明是干細胞不對稱分裂的關鍵調控因子，并被鑒定為大鼠腸道干細胞和早期譜系祖細胞的標志物，其標記了大量隱窩細胞[12]。上述免疫組織化學結果提示，移植的HF-MSC歸巢于受損的結腸組織，參與黏膜修復。

腸道干細胞是腸道再生的最佳來源，MSC移植有潛力成為治療UC的優(yōu)選。動物實驗和臨床研究表明同種異體和自體MSC移植可能可以有效誘導UC緩解[13-15]。這種療效的機制可能包括局部免疫調節(jié)和直接進行組織修復等[16-17]。今后需進一步研究來闡明具體機制，尤其是腸道微生物群、腸道屏障、免疫系統(tǒng)及腸道干細胞調節(jié)與UC之間復雜的相互作用。

綜上所述，體外擴增的HF-MSC在移植后能識別UC病變組織，隨后遷移到腸道受損部位，繼而增殖并轉分化為腸道干細胞，以修復受損的結腸組織。HF-MSC具有再生特性，能減輕DSS誘導的大鼠結腸損傷。本研究結果顯示HF-MSC移植對UC大鼠模型具有療效，但今后需進行臨床前研究和臨床試驗以驗證HF-MSC移植對UC患者的治療作用。