王利公 趙 珊 陶 慧 紀(jì)瑞靜

在中國，慢性乙型肝炎(CHB)的發(fā)病率較高，其引發(fā)的肝硬化及其他慢性肝病的病死率逐年升高[1]。隨著CHB病程進(jìn)展，會(huì)發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[2]。早期評(píng)估CHB患者的肝纖維化程度并及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，可有效抑制疾病進(jìn)展。目前，肝組織病理檢查是評(píng)價(jià)肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于存在觀察者誤差、取樣誤差及具有創(chuàng)傷性等原因而難以在臨床廣泛開展[3]。AST/血小板計(jì)數(shù)(PLT)比值(APRI)、肝纖維化指數(shù)(FIB-4)等肝纖維化血清學(xué)模型雖具有獲取簡(jiǎn)單、無創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)，但難以準(zhǔn)確反映肝纖維化程度[4]。蛋白激酶D3(PKD3)是結(jié)合二?；视秃头鸩サ慕z氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中一員，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及分化等方面均發(fā)揮重要作用[5]。研究表明，敲除PKD3基因可促使巨噬細(xì)胞極化，向促纖維化表型轉(zhuǎn)化，從而加重小鼠肝纖維化程度[6]。由此推測(cè)，PKD3可能參與了CHB向肝纖維化進(jìn)展的過程，檢測(cè)其表達(dá)水平有望了解肝纖維化程度。本研究比較了不同肝纖維化程度的CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平，并分析PKD3評(píng)價(jià)肝纖維化程度的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年4月至2020年5月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的128例CHB患者作為研究對(duì)象。參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]診斷CHB，并判斷肝纖維化程度。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為CHB；(2)接受肝臟活體組織穿刺檢查；(3)年齡>18歲；(4)入組前未接受抗病毒或抗纖維化治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有自身免疫性疾??；(2)伴有惡性腫瘤；(3)失代償期肝硬化患者；(4)伴有甲型肝炎、酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎等。128例患者中，男性79例，女性49例，年齡20～66歲，平均年齡為(45.06±11.23)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)2018FG121)，患者均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料

收集128例CHB患者的年齡、性別，以及肝臟活體組織穿刺檢查當(dāng)日的AST、ALT和PLT等臨床資料，并計(jì)算ARPI和FIB-4。APRI=(AST/正常值上限×100)/PLT。FIB-4=(年齡×AST)/(PLT×ALT1/2)。

1.3 肝纖維化病理分期

采用超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝臟活體組織穿刺檢查獲取長度為1.5～2.0 cm的肝臟組織，使用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片。采用H-E染色法和Masson染色法觀察肝臟組織的病理變化。肝纖維化病理分期標(biāo)準(zhǔn)如下：S0期表示無纖維化；S1期表示匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限于竇周及小葉內(nèi)纖維化；S2期表示匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3期表示有纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4期表示早期肝硬化。本研究將≥S2期定義為顯著纖維化[7]。

1.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平檢測(cè)

采用Ficoll密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞[8]。抽取所有受試者空腹肘部靜脈血5 mL，室溫下800 r/min離心15 min(離心半徑為10 cm)，提取離心后的沉淀物，將其置于10 mL Ficoll分離液中，從中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平[9]。具體步驟：使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度；配置10% SDS-PAGE分離膠，在120 V電壓下電泳，直至溴酚藍(lán)跑出膠面，轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡3次，在300 mA電流下轉(zhuǎn)膜60 min，用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜3次，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；PBST洗膜3次，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，使用ELC發(fā)光液顯影。應(yīng)用ImageJ軟件讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同肝纖維化程度CHB患者的PKD3表達(dá)水平比較

在本研究的128例CHB患者中，S0期20例(15.63%)，S1期28例(21.88%)，S2期36例(28.13%)，S3期20例(15.63%)，S4期24例(18.75%)。128例CHB患者的AST表達(dá)水平為62.01(58.98)IU/L，ALT表達(dá)水平為118.57(115.85)IU/L，PLT水平為(129.22±29.16)×109/L，APRI為0.51(0.50)，F(xiàn)IB-4為0.46(0.46)，PKD3相對(duì)表達(dá)量為0.80±0.28。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，S0期、S1期、S2期、S3期和S4期CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的相對(duì)表達(dá)量分別為1.11±0.26、1.02±0.18、0.77±0.14、0.64±0.10和0.45±0.09，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.236，P<0.001)。與S0期和S1期患者相比，S2期、S3期和S4期患者的PKD3相對(duì)表達(dá)量均較低，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與S2期和S3期患者相比，S4期患者的PKD3相對(duì)表達(dá)量較低，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 不同肝纖維化程度CHB患者的PKD3表達(dá)水平比較

2.2 PKD3與其他模型的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PKD3與肝纖維化病理分期、ARPI和FIB-4均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.842，P<0.001；rs=-0.468，P<0.001；rs=-0.235，P=0.008)。

2.3 PKD3與其他模型評(píng)價(jià)肝纖維化程度的效能比較

PKD3診斷≥S2期肝纖維化的ROC曲線下面積(AUC)大于ARPI和FIB-4，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.008，P<0.001；Z=5.054，P<0.001)，見表1、圖2A。PKD3診斷S4期肝纖維化的AUC大于ARPI和FIB-4，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.580，P<0.001；Z=4.837，P<0.001)，見表2、圖2B。

表1 各模型診斷≥S2期肝纖維化的效能

表2 各模型診斷S4期肝纖維化的效能

圖2 各模型診斷肝纖維化程度的ROC曲線 A ≥S2期肝纖維化 B S4期肝纖維化

3 討論

準(zhǔn)確診斷CHB患者的肝纖維化程度對(duì)于制定臨床治療方案、評(píng)價(jià)療效及預(yù)后轉(zhuǎn)歸均有較高價(jià)值[10]。肝組織學(xué)病理檢查是診斷肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但部分患者接受該檢查后出現(xiàn)不適癥狀，且會(huì)升高并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。此外，肝組織學(xué)病理檢查結(jié)果僅反映所取肝組織的纖維化程度，并不能反映患者整個(gè)肝臟的纖維化程度[12]。因此，臨床亟需能夠準(zhǔn)確反映肝纖維化程度的模型。本研究檢測(cè)了不同肝纖維化程度的CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示S2期、S3期和S4期CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平均低于S0期和S1期患者，且S4期CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平低于S2期和S3期患者，上述結(jié)果提示PKD3可能參與了肝纖維化進(jìn)展，檢測(cè)CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平有望診斷肝纖維化程度。

近年來，采用無創(chuàng)性檢查方法診斷肝纖維化程度是研究的重點(diǎn)方向。目前，診斷CHB肝纖維化程度的模型主要包括APRI、FIB-4、S指數(shù)和Frons指數(shù)等，但上述模型均存在一定不足。左中寶等[3]對(duì)CHB患者的研究指出，APRI、FIB-4、S指數(shù)和Frons指數(shù)診斷≥S2期肝纖維化的AUC分別為0.80、0.73、0.81和0.71；診斷S4期肝纖維化的AUC分別為0.71、0.74、0.77和0.74；此外，各模型的敏感度或特異度較低，診斷效能一般。沈崔琴等[13]的研究顯示，APRI、FIB-4診斷CHB患者≥S2期肝纖維化的AUC分別為0.75、0.72，診斷S4期肝纖維化的AUC分別為0.79、0.75，該結(jié)果同樣提示APRI和FIB-4診斷肝纖維化程度的效能一般。APRI和FIB-4因具有獲取所需數(shù)據(jù)的操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用較低、無創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)，被歐洲肝病指南推薦為診斷CHB患者肝纖維化程度的模型，尤其適用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)[14]。本研究的結(jié)果顯示，PKD3診斷≥S2期、S4期肝纖維化的AUC分別為0.931、0.977，均大于ARPI和FIB-4，這提示CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平對(duì)于診斷肝纖維化程度具有較高價(jià)值。

綜上所述，CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PKD3的表達(dá)水平越低，提示肝纖維化程度越嚴(yán)重。本研究的不足之處在于為單中心研究，且納入的樣本量較小，今后課題組將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證PKD3在診斷CHB患者肝纖維化程度方面的價(jià)值。