楊利俊，張 謙

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

支原體肺炎為兒童常見(jiàn)社區(qū)獲得性肺炎，占全部?jī)和窝椎?0%左右[1]。支原體肺炎具有發(fā)病隱匿、易復(fù)發(fā)、病情遷延不愈等特點(diǎn)。輕癥患兒多僅有發(fā)熱和咳嗽癥狀，無(wú)呼吸困難表現(xiàn)，而重癥患兒可合并胸腔積液，甚至包括呼吸系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)功能障礙等，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量，甚至危及生命[2]。有研究表明，異常免疫反應(yīng)及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是支原體肺炎的重要發(fā)病機(jī)制[3]。微小核糖核酸(miRNA)為一類長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼單鏈RNA分子。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)的作用[4]。CHU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎患兒外周血miR-222-3p水平明顯升高，尤其在合并胸腔積液患兒中高表達(dá)。有研究指出，miR-155參與調(diào)控免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等多種細(xì)胞功能，且可通過(guò)靶向調(diào)控多種細(xì)胞因子表達(dá)，參與肺炎等肺部疾病發(fā)生和發(fā)展[6]。故miR-222和miR-155在支原體肺炎中的表達(dá)及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系值得進(jìn)一步探討。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)支原體肺炎患兒血清miR-222和miR-155水平，探討二者與病情嚴(yán)重程度、潮氣呼吸肺功能的關(guān)系，旨在為支原體肺炎的臨床診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2020年12月本院收治的188例支原體肺炎患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)3～16歲；(2)符合支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(3)可配合進(jìn)行潮氣呼吸肺功能檢測(cè)；(4)患兒及其法定監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并細(xì)菌、病毒、肺炎衣原體等感染；(2)既往有呼吸系統(tǒng)疾病史；(3)合并慢性基礎(chǔ)疾病，嚴(yán)重肝、腎等臟器功能不全，自身免疫性疾病，哮喘；(4)近1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)抗感染治療。根據(jù)病情嚴(yán)重程度將188例患兒分為輕癥組和重癥組[7]，輕癥組96例，男44例，女52例；年齡3～15歲，平均(6.34±2.12)歲；重癥組92例，男41例，女51例；年齡4～14歲，平均(6.28±2.23)歲。選擇同期本院體檢健康兒童作為健康對(duì)照組，無(wú)呼吸系統(tǒng)感染、自身免疫性疾病及相關(guān)病史，且近1個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)抗感染治療。健康對(duì)照組共84例兒童，男37例，女47例；年齡3～15歲，平均(6.37±2.25)歲。3組兒童性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2血清miR-222和miR-155水平檢測(cè) (1)采集所有研究對(duì)象空腹外周靜脈血2 mL，分離血清，加入TRIzol試劑(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)GL1311)提取總RNA，測(cè)定RNA純度和水平。(2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司(貨號(hào)205111)。(3)由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)引物序列。miR-222上游引物：5′-GCGAGCTACATATGTGGA-3′，下游引物：5′-CATGGCGTGTAGTGGAGT-3′。miR-155上游引物：5′-GGGACGTGGTTTAAGTGC-3′，下游引物：5′-CCGTTTGCAACTGTGTAT-3′。U6為內(nèi)參，上游引物：5′-ATTGGACAGTATGACAAA-3′。(4)引物合成后，PCR儀(美國(guó)賽默飛世爾公司，型號(hào)ProFlex)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。反應(yīng)體系：SYBRTMGreen PCR Master Mix(美國(guó)賽默飛世爾公司，貨號(hào)4309155)10.0 μL，cDNA 1.0 μL，上游和下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1次，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，1次。(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)，Ct=—1/lg(1+Ex)×lgX0+lgN/lg(1+Ex)，其中Ex為擴(kuò)增效率，X0為初始模板量，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)到達(dá)閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量，采用2—ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.3潮氣呼吸肺功能檢測(cè) 檢查當(dāng)日清理鼻腔分泌物，保持上呼吸道通暢；操作盡量避免進(jìn)餐期間，可于進(jìn)食后30 min至2 h進(jìn)行；測(cè)量?jī)和w質(zhì)量，精確至0.5 kg；檢查前，幼兒及配合度較差兒童根據(jù)體質(zhì)量給予10%水合氯醛，劑量為0.5 mL/kg，口服或保留灌腸，配合度較好兒童囑靜坐；選擇適宜大小面罩，緊扣口鼻，保證無(wú)漏氣；調(diào)節(jié)肺功能儀(德國(guó)耶格醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)MasterScreen PFT System)參數(shù)，待呼吸平穩(wěn)后，連續(xù)記錄5次，每次記錄100個(gè)潮氣呼吸流量-容積環(huán)，取平均值作為最終結(jié)果。

1.4觀察指標(biāo) 分析各組血清miR-222、miR-155水平及潮氣呼吸肺功能指標(biāo)，其中潮氣呼吸肺功能指標(biāo)包括呼吸頻率(RR)、潮氣量(VT)、呼氣時(shí)間(Te)、達(dá)峰時(shí)間(TPTEF)、達(dá)峰容積(VPTEF)，達(dá)峰時(shí)間/呼氣時(shí)間(TPTEF/Te，%)=TPTEF/Te×100%，達(dá)峰容積/潮氣量(VPTEF/VT，%)=VPTEF/VT×100%。

2 結(jié) 果

2.13組兒童血清miR-222和miR-155水平比較 與健康對(duì)照組比較，輕癥組、重癥組兒童血清miR-222和miR-155水平明顯升高，且重癥組高于輕癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組兒童血清miR-222和miR-155水平比較

2.23組兒童潮氣呼吸肺功能比較 與健康對(duì)照組比較，輕癥組、重癥組兒童VT、TPTEF/Te和VPTEF/VT明顯降低，RR明顯升高，且重癥組較輕癥組變化更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組兒童潮氣呼吸肺功能比較

2.3血清miR-222、miR-155水平與病情嚴(yán)重程度、潮氣呼吸肺功能的相關(guān)分析 血清miR-222、miR-155水平分別與VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT呈負(fù)相關(guān)，與病情嚴(yán)重程度、RR呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 血清miR-222、miR-155與病情嚴(yán)重程度、潮氣呼吸肺功能的相關(guān)分析

2.4支原體肺炎患兒病情嚴(yán)重程度的多元Logistic回歸分析 以miR-222和miR-155為自變量，病情嚴(yán)重程度為因變量，進(jìn)行多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-222、miR-155水平升高為影響支原體肺炎病情嚴(yán)重程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 支原體肺炎患兒病情嚴(yán)重程度的多元Logistic回歸分析

2.5支原體肺炎患兒潮氣呼吸肺功能的回歸分析 以miR-222和miR-155為自變量，潮氣呼吸肺功能為因變量，進(jìn)行多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-222、miR-155水平升高為影響支原體肺炎潮氣呼吸肺功能獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 支原體肺炎患兒潮氣呼吸肺功能的多元Logistic回歸分析

3 討 論

近年來(lái)，我國(guó)兒童支原體肺炎發(fā)病率日趨升高，且有小范圍流行趨勢(shì)[8]。肺部感染支原體后，不僅會(huì)引起呼吸道病變，還可累及其他器官或系統(tǒng)[9]。大量研究表明，免疫[10]及炎性反應(yīng)[11]與兒童支原體肺炎密切相關(guān)。miRNA在支原體肺炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]。miR-155為調(diào)控炎癥因子表達(dá)的重要miRNA。徐長(zhǎng)娣等[13]通過(guò)miRNA芯片技術(shù)篩選支原體肺炎患兒與健康兒童血液淋巴細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎患兒血液淋巴細(xì)胞中共篩選出238個(gè)具有明顯差異的miRNA，與健康兒童比較，支原體肺炎患兒血液淋巴細(xì)胞中miR-155水平明顯上調(diào)。丁瑩等[14]利用miRNA芯片技術(shù)篩選支原體肺炎患兒與健康兒童血漿差異表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎患兒血漿標(biāo)本中共篩選出26個(gè)具有明顯差異的miRNA，與健康兒童比較，支原體肺炎患兒血漿標(biāo)本中miR-222-3p表達(dá)明顯上調(diào)。故筆者猜想與miR-222-3p具有同源性的miR-222也可能在支原體肺炎中異常表達(dá)。

本研究采用RT-PCR法檢測(cè)血清miR-222和miR-155水平發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，輕癥組與重癥組血清miR-222和miR-155水平明顯升高，符合以往研究結(jié)果[5，15]，提示miR-222和miR-155可能參與支原體肺炎發(fā)病機(jī)制，且重癥組高于輕癥組，提示miR-222和miR-155也參與了支原體肺炎進(jìn)展，有可能成為判斷病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。支原體感染可引起氣道炎性反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性，導(dǎo)致肺功能損傷[16]。因此，肺功能檢查成為判斷病情嚴(yán)重程度及預(yù)測(cè)預(yù)后的重要手段，但兒童尤其是幼兒配合度相對(duì)較差，故相比于常規(guī)肺功能檢查，潮氣呼吸肺功能檢測(cè)可能更具有實(shí)用性，無(wú)需患兒特殊配合，且具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、參數(shù)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，輕癥組與重癥組VT、TPTEF/Te和VPTEF/VT明顯降低，RR明顯升高，重癥組變化更明顯，提示支原體肺炎患兒存在小氣道功能和阻塞性通氣功能障礙，且重癥患兒可出現(xiàn)限制性通氣功能障礙。相關(guān)分析得出，血清miR-222、miR-155分別與VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT呈負(fù)相關(guān)，與病情嚴(yán)重程度、RR呈正相關(guān)，表明miR-222、miR-155與支原體肺炎病情嚴(yán)重程度、潮氣呼吸肺功能具有一定關(guān)聯(lián)。通過(guò)多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-222和miR-155水平升高為影響支原體肺炎病情嚴(yán)重程度和潮氣呼吸肺功能的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步證實(shí)miR-222和miR-155在支原體肺炎病情評(píng)估和預(yù)后判斷中的重要價(jià)值。

綜上所述，支原體肺炎患兒血清miR-222和miR-155表達(dá)上調(diào)，且是影響病情嚴(yán)重程度和潮氣呼吸肺功能的重要因素，可作為病情評(píng)估和預(yù)后判斷的指標(biāo)。