余 鳳，李 良，趙 靜

東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)/南京市大廠醫(yī)院病理科，江蘇南京 210044

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在肺癌中是一種常見的類型，其病死率和發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，臨床癥狀主要有咯血、氣促、咳嗽、發(fā)熱等[1-2]。有研究表明，二聚化蛋白(JDP2)是一種轉(zhuǎn)錄活化因子1的抑制物，參與腫瘤細(xì)胞遷移、分化、增殖等過程。糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1(SGK1)具有參與調(diào)控多種生理機(jī)制的功能，SGK1的活性增加和異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)具有磷酸化代謝因子、信號(hào)蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等多種底物的功能，并且在腫瘤發(fā)生及細(xì)胞的生長、發(fā)育等過程中具有重要的作用[5]。本研究回顧性分析了本院收治的76例NSCLC患者的臨床資料，探討JDP2、SGK1、GSK-3β在NSCLC組織中的表達(dá)情況，以及三者的相關(guān)性，為臨床NSCLC治療方案提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年6月至2020年6月本院收治的76例NSCLC患者納入肺癌組，病理科均保存有NSCLC組織標(biāo)本，組織類型包括腺癌42例，鱗癌34例；病程1～2年，平均(1.43±0.40)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合《NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》中關(guān)于NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；均經(jīng)組織病理檢查確診為NSCLC；臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并支氣管炎、肺炎等疾?。缓喜⒚庖呦到y(tǒng)功能缺陷疾??；合并結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等疾病；有溝通障礙或者嚴(yán)重精神病；近期內(nèi)未接受過抗腫瘤治療。選擇同期76例在本院接受過肺組織活檢，并保留有正常肺組織(距腫瘤邊緣>5 cm)的患者納入對照組。所有研究對象中男83例，女69例；年齡46～78歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為24～29 kg/m2；有吸煙史91例，嗜酒史81例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：(2018)倫審第(58)號(hào)。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢測JDP2、SGK1、GSK-3β 采用免疫組化法對NSCLC及正常肺組織中的JDP2、SGK1、GSK-3β進(jìn)行檢測，具體步驟：采用4%的甲醛溶液對組織標(biāo)本進(jìn)行固定，采用石蠟進(jìn)行包埋切片，將組織切片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后采用蒸餾水沖洗3次，每次3 min。隨后將切片浸入枸櫞酸緩沖液(pH值為6)中，對其加熱到100 ℃，3 min后，冷卻至37 ℃，使用PBS緩沖液將其洗滌3次，每次3 min。將3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶滴至切片上，PBS緩沖液洗滌3次，每次3 min。將小鼠抗人PAX-2、Galectin-1多克隆抗體(濃度為1∶100，購自Abbkine公司)滴至切片上，在4 ℃的溫度條件下儲(chǔ)存過夜；PBS緩沖液洗滌3次，在各切片中加入即用型生物素化二抗，在37 ℃的溫度條件下靜置30 min；PBS緩沖液洗滌，將辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液滴至切片上，于37 ℃的溫度下靜置20 min；DAB顯色且蘇木素復(fù)染后，用自來水沖洗3次，乙醇梯度水化，晾干后采用中性樹脂進(jìn)行封片；采用DM-440倒置顯微鏡觀察JDP2、SGK1、GSK-3β表達(dá)。

1.2.2陽性結(jié)果判定 由兩位臨床經(jīng)驗(yàn)>5年的醫(yī)師對陽性細(xì)胞的染色情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)的切片，醫(yī)師需檢測每個(gè)視野下JDP2、SGK1、GSK-3β吸光度和陽性面積，計(jì)算其平均吸光度和陽性面積的平均值。細(xì)胞核染色程度判斷：0分為未見染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細(xì)胞百分率判斷分為4個(gè)等級(jí)：0分為<5%；1分為5%～<25%；2分為25%～<50%；3分為≥50%。最終將細(xì)胞核染色程度結(jié)果與陽性細(xì)胞百分率結(jié)果相乘計(jì)算總分，陰性為<2分，陽性為≥2分，觀察并記錄JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1兩組NSCLC組織中JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達(dá)情況比較 與對照組比較，肺癌組JDP2、GSK-3β陽性表達(dá)率較低，SGK1陽性表達(dá)率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。JDP2、SGK1、GSK-3β在兩組組織中的免疫組化染色情況見圖1～3。

表2 兩組NSCLC組織中JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

注：A為NSCLC組織；B為正常肺組織。

注：A為NSCLC組織；B為正常肺組織。

注：A為NSCLC組織；B為正常肺組織。

2.2不同特征NSCLC患者JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達(dá)情況比較 與腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化程度患者比較，腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度患者JDP2、GSK-3β陽性表達(dá)率較低，SGK1陽性表達(dá)率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腺癌患者JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達(dá)率與鱗癌患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同特征NSCLC患者JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達(dá)情況比較 [n(%)]

2.3JDP2、SGK1、GSK-3β對NSCLC的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，JDP2、SGK1、GSK-3β預(yù)測NSCLC發(fā)生的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.657(95%CI：0.571～0.742，P<0.001)、0.695(95%CI：0.613～0.777，P<0.001)、0.704(95%CI：0.622～0.786，P<0.001)，靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值見表4。

表4 JDP2、SGK1、GSK-3β對NSCLC的預(yù)測價(jià)值(%)

2.4JDP2、SGK1、GSK-3β之間的相關(guān)性 JDP2與SGK1呈負(fù)相關(guān)(r=—0.516，P=0.004)；JDP2與GSK-3β呈正相關(guān)(r=0.991，P=0.001)；SGK1與GSK-3β呈負(fù)相關(guān)(r= —0.230，P=0.045)。

3 討 論

近年來，肺癌的發(fā)病率和病死率逐漸升高，為嚴(yán)重威脅人類身體健康的主要癌癥之一，而NSCLC在肺癌中占86%左右，并且其治愈率較低[7]。目前，治療NSCLC的主要手段是手術(shù)切除，若患者早期被發(fā)現(xiàn)，治愈率較高；若患者發(fā)現(xiàn)患病時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，病死率較高。因此，積極尋找NSCLC發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控因素，對其治療有至關(guān)重要的作用[8-9]。

JDP2可對相應(yīng)區(qū)域組蛋白進(jìn)行激活、結(jié)合、修飾、轉(zhuǎn)錄，其具有抑制特異性癌基因活性的作用[10]。YU等[11]的研究顯示，當(dāng)NSCLC組織中JDP2蛋白表達(dá)減少時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖加快，腫瘤組織生長速度及惡性程度增加，分化程度降低，臨床分期較高。此外，一方面JDP2能夠激活腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，使腫瘤細(xì)胞生長周期加快，從而增加腫瘤組織的惡性程度；另一方面，羧基末端延伸部分與JDP2蛋白進(jìn)行結(jié)合，JDP2具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞基因分化及轉(zhuǎn)錄的作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤惡性發(fā)展[12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，JDP2參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制可能為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶與JDP2結(jié)合，從而抑制腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄及組蛋白的乙?；瑫r(shí)對腫瘤細(xì)胞的分化、增殖及生長周期停滯也具有抑制作用，進(jìn)一步對腫瘤細(xì)胞的臨床分期進(jìn)行抑制[13]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，JDP2在NSCLC組織中表達(dá)異常，且與患者病理特征相關(guān)[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織中JDP2陽性表達(dá)率低，且與腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化程度患者比較，腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度患者JDP2陽性表達(dá)率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示JDP2表達(dá)水平降低可能是導(dǎo)致NSCLC發(fā)生的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步證實(shí)了JDP2參與NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展。ROC曲線分析顯示，JDP2預(yù)測NSCLC發(fā)生的AUC為0.657，靈敏度和特異度分別為60.31%、76.06%。

SGK1屬于糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶家族成員之一，其對機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞增殖和凋亡、神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)活力、激素的釋放等多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用[15]。有研究證實(shí)，SGKl在惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，并且其對腫瘤細(xì)胞的耐藥、自噬、轉(zhuǎn)移及生長具有促進(jìn)作用[16-17]，但是其在NSCLC中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC組織中SGKl陽性表達(dá)率較高。與腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化程度患者比較，腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度患者SGK1陽性表達(dá)率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示SGKl表達(dá)水平異?？赡軈⑴cNSCLC患者發(fā)病的過程。本研究ROC曲線分析顯示，SGKl預(yù)測NSCLC發(fā)生的AUC為0.695，提示SGKl可能是NSCLC發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移及分化的警示指標(biāo)，分析其原因可能為SGKl可導(dǎo)致集落刺激因子l或者糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、黏附能力、細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，若抑制SGKl表達(dá)，可減緩腫瘤細(xì)胞增殖及其腫瘤組織的惡性程度，但目前臨床鮮有研究分析SGKl與NSCLC的關(guān)系，因此，上述結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

GSK-3β在Wnt信號(hào)通路中是一種重要的糖原合成酶激酶，其能夠阻斷Wnt信號(hào)通路，在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中是一個(gè)較為關(guān)鍵的因子，在β-連環(huán)蛋白氨基末端的4個(gè)位點(diǎn)中加入其磷酸根，能夠抑制Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)[18-19]。GSK-3β被認(rèn)為是腫瘤潛在的調(diào)控因子，而GSK-3β在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)功能已被廣泛認(rèn)可，細(xì)胞增殖活化異常及腫瘤形成與異常激活的Wnt信號(hào)靶基因之間關(guān)系密切，而GSK-3β磷酸化細(xì)胞核β-catenin后可抑制其過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中GSK-3β陽性表達(dá)率低于正常肺組織，GSK-3β陽性表達(dá)率與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑有密切的關(guān)系，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度的NSCLC組織中陽性表達(dá)率較低。分析原因：GSK-3β能夠促進(jìn)線粒體介導(dǎo)死亡內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，使死亡受體介導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡受到抑制，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期、基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞骨架的完整性[21]。黃曌等[22]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在NSCLC中表達(dá)降低，認(rèn)為其參與此病的發(fā)生及進(jìn)展。本研究ROC曲線分析顯示，GSK-3β預(yù)測NSCLC發(fā)生的AUC為0.704，是預(yù)測NSCLC發(fā)生的高能預(yù)警指標(biāo)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，JDP2、SGK1、GSK-3β三者間具有相關(guān)性。

綜上所述，NSCLC患者在分化程度較低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ期時(shí)JDP2、GSK-3β陽性表達(dá)率明顯降低，SGK1陽性表達(dá)率明顯升高，說明JDP2、SGK1、GSK-3β與NSCLC發(fā)生關(guān)系密切。