王藝錚，李洪瓊，楊宇焦，萬勇

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000)

膿毒癥患者易發(fā)生急性腎損傷，其致病機(jī)制復(fù)雜，且損傷的嚴(yán)重程度與患者的死亡率增加有關(guān)，改善腎臟損傷對臨床結(jié)局有積極作用[1]。解決低灌注、微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等問題有望提高治愈率[2]。在心臟缺血再灌注相關(guān)研究中，極化液，尤其是其中成分之一胰島素，可通過PI3K-Akt信號通路發(fā)揮抗凋亡作用，從而對缺血后再灌注的心肌提供保護(hù)[3]。眾多研究[4-7]表明，葡糖糖-胰島素-鉀極化液(glucose-insulin-potassium，GIK)能起抗炎、抗凋亡、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、減輕缺血再灌注損傷、促進(jìn)生長因子生成等作用。本研究小組前期已經(jīng)觀察到GIK對內(nèi)毒素血癥大鼠脾臟[8]、肝臟[9]具有保護(hù)作用。本研究旨在觀察GIK對膿毒性休克后腎臟損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性清潔級新西蘭大白兔(12～15周齡)，共30只，體重2.0～3.0 kg，購于川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物許可證編碼：SYXK(川)20165108。本實驗已通過川北醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審查，實驗人員具備動物實驗從業(yè)資格。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 脂多糖(LPS)購于Sigma(USA)公司(貨號：E:coli055:B5)；兔TNF-α ELISA試劑盒購于上海瓦蘭生物科技有限公司(貨號：201610)；兔 Cys-C ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司(貨號：m1027348)；GIK配制方法為：將50%葡萄糖40 mL、10%氯化鉀5 mL、胰島素6.0 IU使用生理鹽水配制成100 mL極化液。 監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療，型號：MEC-2000)；酶標(biāo)儀(上?？迫A，型號：KHB ST-360)；全自動生化分析儀(德國西門子，型號：Rapidiab348)；透射電鏡(Quantum Design，型號H-600IV)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與膿毒血癥休克模型建立 30只大白兔隨機(jī)分空白對照組(C組)、LPS組和GIK組，每組各10只。環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，禁食2 h后稱重記錄。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(2.5 mL/kg)實施麻醉。LPS 組和GIK組耳緣靜脈注射脂多糖0.5 mg/kg，C組以同樣速度注射同等劑量生理鹽水，以LPS 組和GIK組動物2 h內(nèi)直接平均動脈壓降低至基礎(chǔ)值30%～70%且穩(wěn)定達(dá)5 min表示造模成功[10]。

1.2.2 干預(yù)治療 建模成功后，GIK組經(jīng)耳緣靜脈泵注極化液5 mL/h治療；C組和LPS組泵注相同單位體積和速度的復(fù)方氯化鈉溶液治療。

1.2.3 血氣分析及HE染色 干預(yù)治療6 h后，通過經(jīng)左側(cè)頸內(nèi)動脈置入的24 G 動脈套管針連接壓力傳感器，連續(xù)監(jiān)測動脈血壓。設(shè)定動靜脈置管操作結(jié)束后為時間點OT，模型建立成功為時間點T0，開始干預(yù)后的第3小時末為T3，第6小時末為T6。分別于0T、T0、T3、T6通過耳緣靜脈抽取新鮮靜脈血液，3 000 rmp離心5 min，取上清液，分別標(biāo)記并置于-70 °C低溫冰箱保存?zhèn)溆?；分別于OT、T0、T3、T6通過頸內(nèi)動脈抽取血液標(biāo)本進(jìn)行血氣分析。6 h后實驗結(jié)束，經(jīng)耳緣靜脈注射10 mL空氣處死動物并立即開腹取右側(cè)腎臟標(biāo)本，右側(cè)上1/2腎組織稱重后使用緩沖液 PBS制備組織勻漿；右側(cè)下1/2腎組織均分為兩塊，分別使用4%多聚甲醛溶液和3%戊二醛固定，用于病理切片HE染色和電鏡切片。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)平均動脈壓(MAP)：經(jīng)左側(cè)頸內(nèi)動脈置入的24 G 動脈套管針連接壓力傳感器，使用上述監(jiān)護(hù)儀連續(xù)監(jiān)測動脈血壓。記錄OT、T0、T3、T6時間點血壓值。(2)生化指標(biāo)(血鉀、乳酸、血糖)和肌酐(Scr)值：分別于OT、T0、T3、T6抽取頸內(nèi)動脈血行血氣分析，及測量血鉀、乳酸、血糖值。使用-70℃低溫冰箱保存的血漿檢測Scr值。(3)腎臟組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)和靜脈血漿中胱抑素C(Cys-C)：采用ELISA 法檢測。取新鮮腎臟組織勻漿，3 500 rmp離心10 min，取上清液。在標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，空白孔不加。封板，37 ℃恒溫箱孵育60 min。清洗液清洗5次，拍打去除孔內(nèi)氣泡。每個孔迅速加入50 μL顯色試劑A，再立即分別加入50 μL顯色試劑B，37 ℃恒溫箱內(nèi)避光孵育15 min。加入50 μL終止液，15 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀測量450 nm處各孔的吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中TNF-α和MDA濃度。于OT、T0、T3、T6從耳緣靜脈抽取靜脈血上清液樣本，按照上文描述操作并計算Cys-C的實際濃度；(4)腎小管微觀結(jié)構(gòu)：將腎臟組織按照大小0.5～1.0 mm2修剪，3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%→100%→100%，將脫完水的組織先后經(jīng)過脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液，兩試劑比例分別為3∶1、1∶1、1∶3，每步30～60 min。將滲透好的樣品塊放到適當(dāng)模具中，灌上包埋液包埋，經(jīng)加溫聚合形成包埋塊。超薄切片機(jī)切出50 nm左右的超薄切片，切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，撈至于銅網(wǎng)上，室溫下雙染色法染色15～20 min。使用H-600IV透射電鏡觀察，記錄拍照；(5)腎臟病理切片：將固定于4%多聚甲醛溶液中72 h的腎臟組織，經(jīng)過全自動脫水機(jī)梯度脫水、修剪、石蠟包埋切片、HE 染色、封片后，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。先于40×鏡下觀察大體病變，再選擇需觀察區(qū)域采集400×圖片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GIK對膿毒癥休克兔生命體征的影響

組內(nèi)比較，注射LPS后LPS組和GIK組實驗動物血壓下降(P<0.05)；LPS組補液治療后血壓適當(dāng)回升，但從T3不再升高，隨后緩慢下降；而使用GIK治療的動物血壓回升程度始終高于LPS組，并持續(xù)保持到實驗結(jié)束(P<0.05)。見圖1。

2.2 GIK對膿毒癥休克兔生化指標(biāo)的影響

注射LPS后，動物血糖升高(P<0.05)，隨后逐漸下降，但LPS組血糖下降程度大于GIK組(P<0.05)。在T6時，LPS組血糖均值已經(jīng)低于3.9 mmol/L，而GIK組穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)，且與OT時組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；注射LPS后，動物的乳酸持續(xù)升高(P<0.01)，并保持此趨勢至實驗結(jié)束，但至T6時GIK組升高程度低于LPS組(P<0.05)；實驗開始后，C組動物血鉀逐漸降低(P<0.05)，LPS組雖然也呈降低趨勢，但程度小于C組(P<0.05)，而GIK組血鉀始終高于LPS組(P<0.05)和C組(P<0.05)，并始終維持穩(wěn)定。見圖2。

2.3 GIK對膿毒癥休克兔腎臟功能指標(biāo)的影響

各組Scr水平從T3開始就出現(xiàn)差異(P<0.05)，并持續(xù)至T6；GIK組和LPS組Scr水平水平高于正常對照組(P<0.05)，且LPS組高于GIK組(P<0.05)。LPS組和GIK組動物Cys-C 水平從T3開始高于C組(P<0.05)，且LPS組高于GIK組(P<0.05)，直至實驗結(jié)束。見表1及表2。

表1 各組兔各時間Scr水平比較

表2 各組兔各時點Cys-C水平比較

2.4 GIK對膿毒癥休克兔腎臟組織炎癥和過氧化水平的影響

LPS組和GIK組TNF-ɑ和MDA均高于C組(P<0.05)，且LPS組高于GIK組(P<0.05)。見表3。

表3 各組兔腎組織TNF-ɑ和MDA水平比較

2.5 腎組織電鏡觀察結(jié)果

正常對照組內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛豐富，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞器清晰可見；LPS組腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，胞漿內(nèi)線粒體腫脹；GIK組上皮細(xì)胞表面微絨毛豐富，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)線粒體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體等細(xì)胞器清晰可見。見圖3。

2.6 腎組織病理切片HE染色結(jié)果

正常對照組腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，皮質(zhì)區(qū)域腎小球結(jié)構(gòu)未見異常，腎小管和集合管排列規(guī)則、有序，未見明顯病理變化；LPS組腎臟組織皮質(zhì)區(qū)腎小管和集合管上皮細(xì)胞可見大量水腫壞死，間質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張充血；GIK組腎臟組織皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，皮質(zhì)區(qū)域腎小球結(jié)構(gòu)未見異常，腎小管和集合管排列規(guī)則、有序，可見部分上皮細(xì)胞水腫、空泡化。見圖4。

3 討論

本實驗中，LPS組實驗動物遭受LPS攻擊后(T0)出現(xiàn)動脈血壓劇烈下降，經(jīng)過補液治療，血壓緩慢回升，但從T3開始，血壓達(dá)到平臺期，后再次下降；而GIK組動物的血壓緩慢回升，在T3達(dá)到平臺期后保持此血壓水平至T6，說明GIK能在此動物模型休克早期更好地維持血流動力學(xué)穩(wěn)定，與GIK可改善膿毒癥休克患者血流動力學(xué)水平的報道一致[11]。文獻(xiàn)表明在膿毒癥休克早期盡快液體復(fù)蘇至關(guān)重要[12-14]，本研究結(jié)果也表明在早期使用GIK干預(yù)治療對血流動力學(xué)穩(wěn)定有積極意義。

線粒體功能障礙是膿毒癥動物體內(nèi)由微循環(huán)障礙、炎癥介質(zhì)和(或)過量活性氧攻擊造成的，遭到損傷的線粒體內(nèi)外膜通透性，最終形成線粒體內(nèi)呼吸障礙，使線粒體無法通過正常的氧化磷酸化產(chǎn)生能量，進(jìn)而嚴(yán)重影響腎臟的分泌和重吸收[15-16]。在本研究中，經(jīng)過GIK干預(yù)的動物的血糖水平波動較LPS組更小。相關(guān)研究表明，高血糖、低血糖和血糖波動大與膿毒癥患者的高死亡率直接相關(guān)[17]，故GIK干預(yù)的動物血糖水平更穩(wěn)定是有利于膿毒癥結(jié)局的。且GIK組血鉀水平波動也更小，乳酸升高幅度更平緩，表明GIK干預(yù)治療使實驗動物的微循環(huán)障礙得到改善。炎癥反應(yīng)也是膿毒癥休克急性腎損傷的機(jī)制[18]，在膿毒癥和膿毒性休克中，TNF-α能夠造成臟器損傷，最終發(fā)展為包括急性腎損傷在內(nèi)的多器官功能障礙綜合征[19]，TNF-α表達(dá)受到抑制有利于促使失控的促炎/抗炎反應(yīng)趨于平衡，減輕腎臟組織受到的攻擊。有證據(jù)[20]表明，在膿毒癥患者和膿毒癥動物中血清及腎臟組織TNF-α水平升高程度與腎臟的器官損傷程度一致。本實驗GIK組腎臟組織中TNF-α水平較LPS組顯著降低，推測是由于GIK能通過減少NF-κB、MAPK通路激活，進(jìn)而減少TNF-α的產(chǎn)生和釋放。膿毒性腎損傷微循環(huán)障礙改變及炎性物質(zhì)大量產(chǎn)生會導(dǎo)致過氧化水平升高，使氧化與抗氧化失衡，大量的過氧化物質(zhì)會直接損傷DNA、抑制線粒體呼吸酶和Na+-K+-ATP酶、激活凋亡酶，造成組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷，減少過氧化物生成是減輕過氧化物損傷的主要手段[16]。丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化的指標(biāo)，本實驗中LPS組腎臟組織MDA水平劇烈升高，經(jīng)GIK干預(yù)后MDA明顯降低。說明GIK干預(yù)能減輕腎臟細(xì)胞過氧化水平，可減少過氧化產(chǎn)物對組織的損傷。同時，高水平的MDA能直接降低線粒體脂質(zhì)雙層膜流動性，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，MDA水平下降有利于維持線粒體正常結(jié)構(gòu)。本研究通過電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS組腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹明顯，而GIK組胞漿內(nèi)線粒體等細(xì)胞器超微機(jī)構(gòu)清晰可見，腫脹程度明顯減輕或者無線粒體腫脹及膜斷裂。以上實驗結(jié)果表明，極化液可通過減輕微循環(huán)障礙、減少炎癥因子釋放、減少過量活性氧的攻擊而減輕膿毒癥兔腎臟上皮細(xì)胞的線粒體損傷。

綜上，極化液早期干預(yù)有利于維持膿毒癥休克兔血流動力學(xué)穩(wěn)定，并通過減輕微循環(huán)障礙、減少炎癥因子釋放、減少過量活性氧的攻擊而減輕膿毒癥兔腎臟上皮細(xì)胞的線粒體損傷，從而對膿毒癥兔的腎臟損傷有一定的保護(hù)作用，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。