耿燕娜，常杰，婁婷婷，尹元元，武毅君

杜仲葉為杜仲科植物杜仲

Eucommia ulmoides Oliv

的干燥葉。其功能主治為：補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第11冊(cè)收載有杜仲平壓片，主要成分為杜仲葉提取物，適用于高血壓，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸痛，筋骨萎軟等，是理想的中藥降壓藥物。漂浮型脈沖釋藥系統(tǒng)是將胃滯留和脈沖釋藥原理相結(jié)合，延長制劑在消化道的滯留時(shí)間，保證藥物的釋放和吸收。高血壓病人的血壓峰值在早晨6—9點(diǎn)，是具有晝夜節(jié)律特性的一類疾病，目前上市的含杜仲葉成分降壓藥有杜仲平壓片，文獻(xiàn)報(bào)道有杜仲葉提取物滴丸，是普通藥物劑型，治療存在一定局限性。根據(jù)時(shí)辰藥理學(xué)原理，按生物時(shí)間節(jié)律特點(diǎn)設(shè)計(jì)的杜仲漂浮型脈沖釋放片，可在病人方便時(shí)服藥，在病人血壓高時(shí)釋藥，提高治療效果和病人依從性。

本研究前期已確定了片芯處方，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了包衣處方、壓片壓力等因素對(duì)制劑體外釋藥及漂浮性能的影響。本研究于2018年1—12月在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以釋藥時(shí)滯和起漂時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取外層包衣層中羥丙甲纖維素（HPMC）、乳糖、碳酸氫鈉含量的百分比為考察因素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化最佳處方，工藝穩(wěn)定可靠，合理可行，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)與臨床需求，為杜仲漂浮型脈沖釋放片的進(jìn)一步體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2600 型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；ZRS-8GD 型智能溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；ZP8 旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)（上海天和制藥機(jī)械有限公司）；TG16臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；ME104 電子天平[梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司，最小稱量0.1 mg］；PS-2060 型秒表（深圳市追日電子科技有限公司）。

1.2 試藥

杜仲葉提取物（實(shí)驗(yàn)室自制，杜仲葉由河南省靈寶市中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心杜仲研究基地提供，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院李欽教授鑒定為杜仲科植物杜仲

Eucommia ulmoides Oliv

的干燥葉）；綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-200212）；HPMC（湖州展望藥業(yè)有限公司，批號(hào)20170903）；碳酸氫鈉（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160804）；乳糖（生產(chǎn)商：德國美劑樂集團(tuán)上海代表處，批號(hào)L1406A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 杜仲漂浮型脈沖釋放片的制備

將杜仲葉提取物與各輔料均勻混合，加入適量的微粉硅膠，使用7 mm 沖模將粉末壓制為片芯，片芯質(zhì)量100 mg，其中杜仲葉提取物42 mg。將HPMC、碳酸氫鈉、乳糖、微粉硅膠、微晶纖維素按一定比例均勻混合作為包衣層材料，備用。將一半包衣材料置于10 mm 沖模中，鋪平，速釋片芯置于包衣材料中間，然后將剩余一半包衣材料加入沖模中，調(diào)整壓力進(jìn)行壓片制得杜仲漂浮型脈沖釋放片。

2.2 杜仲漂浮型脈沖釋放片含量測定方法的建立

2.2.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取5 mg 綠原酸對(duì)照品至10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻備用。精密量取該儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度（C）為2，4，6，8，10，12，14，16，18 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mol/L 鹽酸溶液定容，取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于325 nm 波長處測吸光度（

A

），以質(zhì)量濃度（

C

）對(duì)

A

作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)方程

A

=0.0482

C

+0.0066，

r

=0.9997。表明綠原酸質(zhì)量濃度在2～18 mg/L 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2

體外釋放度測定及數(shù)據(jù)處理 釋放度的測定按《中華人民共和國藥典（2015年版）》四部通則溶出度測定法項(xiàng)下第二法漿法操作，以0.1 mol/L 鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，溫度（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速50 r/min，按照設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣，于325 nm處測定

A

，計(jì)算累積釋放率。對(duì)于脈沖釋藥系統(tǒng)，釋藥時(shí)滯通常是指藥物累積釋放百分率達(dá)10% 的時(shí)間。本研究采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0 對(duì)時(shí)滯前后藥物釋放百分率進(jìn)行l(wèi)ogistic 方程擬合，并根據(jù)擬合方程計(jì)算釋藥時(shí)滯。起漂時(shí)間為漂浮型脈沖釋放片放入溶出介質(zhì)中至完全漂浮在溶出介質(zhì)表面的時(shí)間。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)藥物累積釋放影響較顯著因素：包衣層處方中HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比（%）為考察因素，采用Design-Expert 8.06 軟件安排3 因素5 水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各考察因素水平代碼值及其水平的具體取值見表1；以釋藥時(shí)滯Y（h）和起漂時(shí)間Y（s）為考察指標(biāo)；試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及結(jié)果見表2。

表1 杜仲漂浮型脈沖釋放片星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表/%

表2 杜仲漂浮型脈沖釋放片星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert 8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理及效應(yīng)面法處方優(yōu)化，分別以釋藥時(shí)滯（Y）和起漂時(shí)間（Y）為因變量，以包衣層處方中HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比為自變量進(jìn)行多元線性和二次多項(xiàng)式方程擬合，多元線性回歸方程：Y=8.32981+0.15768X-0.16931X-0.23185X（

P

＜0.0001，

R

=0.8110），Y=470.29775-0.42226X-2.50257X-15.13642X（

P

＜0.0004，

R

=0.6651）；二次多項(xiàng)式方程：Y=-9.09992+1.28581X-0.20171X-0.10055X-0.003634 41XX-0.016357XX+0.021035XX-0.012138X-0.006981 59X-0.001531 98X（

P

＜0.0001，

R

=0.9655），Y=1729.01264-27.13323X-29.38339X-79.1623X+0.55192XX-0.018773XX-0.048809XX+0.26747X+0.28249X+1.63913X（

P

＜0.0001，

R

=0.9668）。由擬合方程結(jié)果可知，多元線性方程相關(guān)系數(shù)低，預(yù)測性差（

R

為0.8110 和0.6651），二次多項(xiàng)式方程的擬合度均大于多元線性回歸方程（

R

為0.9655 和0.9668），Y和Y模型均

P

＜0.0001，說明兩個(gè)模型擬合較好。 另外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X），XX，XX，X對(duì)釋藥時(shí)滯具有顯著性影響，乳糖（X）、碳酸氫鈉（X），X對(duì)起漂時(shí)間具有顯著性影響（

P

＜0.05）。根據(jù)二次多項(xiàng)式擬合方程，采用Design-Expert 8.06設(shè)計(jì)軟件，繪制兩因素對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)的三維效應(yīng)面圖，結(jié)果見圖1。

圖1 包衣層中各因素用量對(duì)杜仲漂浮型脈沖釋放片釋藥時(shí)滯和起漂時(shí)間影響的三維效應(yīng)面：1A為羥丙甲纖維素（HPMCK15M）（X1）、乳糖（X2）對(duì)釋藥時(shí)滯的影響；1B為HPMCK15M（X1）、乳糖（X2）對(duì)起漂時(shí)間的影響；1C為HPMCK15M（X1）、碳酸氫鈉（X3）對(duì)釋藥時(shí)滯的影響；1D為HPMCK15M（X1）、碳酸氫鈉（X3）對(duì)起漂時(shí)間的影響；1E為乳糖（X2）、碳酸氫鈉（X3）對(duì)釋藥時(shí)滯的影響；1F為乳糖（X2）、碳酸氫鈉（X3）對(duì)釋藥時(shí)滯的影響 圖2 驗(yàn)證杜仲漂浮型脈沖釋放片優(yōu)化處方的體外釋藥曲線（n=6）

2.4 效應(yīng)面分析預(yù)測與處方優(yōu)化

釋藥時(shí)滯（Y）和起漂時(shí)間（Y）是影響杜仲漂浮型脈沖釋放片處方研究的重要因素，高血壓在凌晨時(shí)癥狀較為嚴(yán)重，該研究設(shè)計(jì)的杜仲漂浮型脈沖釋放片臨睡前服用，遇到胃液后迅速漂?。?0 s）起來，并持續(xù)一段時(shí)間（6 h）后藥物迅速釋放，以保證在疾病發(fā)作時(shí)藥物能充分釋放和吸收，發(fā)揮最佳治療效果。根據(jù)Design-Expert 8.06 軟件預(yù)測結(jié)果，HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比為35.21、20.17 和19.93。結(jié)合研究的實(shí)際情況（釋藥時(shí)滯=6 h，起漂時(shí)間=60 s），最終優(yōu)化處方為HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比為35%、20%和20%。

2.5 處方驗(yàn)證

根據(jù)效應(yīng)面法優(yōu)化包衣層的最佳處方為：HPMC、乳糖、碳酸氫鈉分別占包衣層質(zhì)量的35%、20%、20%，微粉硅膠2%，其余微晶纖維素填充，包衣層質(zhì)量0.25 g。制備了3批杜仲漂浮型脈沖釋放片進(jìn)行處方驗(yàn)證，結(jié)果表明釋藥時(shí)滯實(shí)測值與預(yù)測值偏差+1.94%，起漂時(shí)間實(shí)測值與預(yù)測值偏差-3.77%，按此優(yōu)化處方制得的杜仲漂浮型脈沖釋放片在60 s時(shí)迅速起漂，并在一定時(shí)滯（約6 h）后藥物脈沖釋放，達(dá)到預(yù)期效果，結(jié)果見表3，體外釋放曲線圖見圖2。說明本實(shí)驗(yàn)所擬合方程較好地描述指標(biāo)與因素之間的關(guān)系，擬合效果良好，可信度高。偏差=（預(yù)測值-實(shí)測值）/預(yù)測值×100%。

表3 杜仲漂浮型脈沖釋放片優(yōu)化處方預(yù)測值與實(shí)測值的比較（n=3）

3 討論

本研究杜仲漂浮型脈沖釋放片在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過考察體外溶出和膨脹性確定片芯中崩解劑為交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，占片芯質(zhì)量的10%，微晶纖維素和微粉硅膠填充，包衣層質(zhì)量0.25 g。通過單因素實(shí)驗(yàn)表明HPMC對(duì)脈沖釋放片釋藥時(shí)滯的影響顯著，當(dāng)HPMC、乳糖、碳酸氫鈉分別占包衣層質(zhì)量的40%、20%、20% 時(shí)，藥物經(jīng)過6 h左右的時(shí)滯期后，藥物迅速釋放，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0對(duì)時(shí)滯前后藥物累積釋放百分率進(jìn)行l(wèi)ogistic 方程擬合，計(jì)算釋藥時(shí)滯為6.5432，當(dāng)用量超過40% 后，脈沖釋放片的釋藥時(shí)滯會(huì)顯著增加，同時(shí)藥物釋放緩慢，無法實(shí)現(xiàn)脈沖釋放的設(shè)計(jì)要求。因此在進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)，HPMC的范圍定在20%～40%。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法是近年來國內(nèi)外常采用的制劑處方工藝研究的方法，通過非線性模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從而優(yōu)化處方，其特點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，直觀，精密度高，應(yīng)用方便，預(yù)測值與真實(shí)值更接近。本研究依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化包衣層的最佳處方為：HPMC、乳糖、碳酸氫鈉分別占包衣層質(zhì)量的35%、20%、20%，微粉硅膠2%，其余微晶纖維素填充。釋藥初期包衣層材料中碳酸氫鈉和胃液起反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，二氧化碳黏附在包衣層材料中使脈沖釋放片迅速漂浮在胃液中，凝膠材料HPMC吸水形成凝膠層，使水分難以滲透進(jìn)入片芯，所以釋藥初期藥物基本不釋放。隨著釋藥過程的進(jìn)行，包衣層中碳酸氫鈉的減少，乳糖逐步溶解形成孔道，水分加速滲透進(jìn)入片芯，片芯中的藥物通過凝膠層溶解擴(kuò)散開始有少量釋放，隨著凝膠材料的不斷溶蝕，崩解劑吸水片芯開始膨脹，其膨脹力越來越強(qiáng)，當(dāng)膨脹力撐破凝膠層后藥物迅速釋放，實(shí)現(xiàn)了藥物在體內(nèi)滯留一定時(shí)間后脈沖釋藥的目標(biāo)，避免了制劑脈沖釋放時(shí)藥物已通過吸收部位的問題，保證了藥物的吸收，達(dá)到定時(shí)定位的目的。

高血壓病人血壓波動(dòng)的高峰常發(fā)生于凌晨，病人服藥不方便，特別是老年高血壓病人更易引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等慢性疾病。杜仲葉資源豐富，有明顯的降壓作用，但未得到有效的開發(fā)利用，成藥品種少，本研究以杜仲葉提取物為原材料制得的杜仲漂浮型脈沖釋放片在胃內(nèi)滯留一段時(shí)間，外層包衣層材料經(jīng)過骨架擴(kuò)散溶蝕，片芯遇水后開始迅速崩解釋放藥物，達(dá)到了病人在臨睡前服用藥物，凌晨血壓升高時(shí)釋放藥物，使血藥濃度快速升高，及時(shí)控制疾病癥狀的目的。為杜仲葉的臨床應(yīng)用提供了參考，為杜仲漂浮型脈沖釋放片的體內(nèi)釋放特性及體內(nèi)外相關(guān)性研究提供了依據(jù)。

（本文圖1，2見插圖12-1）