尹青春，張容鵠，吳 廣，王承業(yè)，段宙位，謝 輝，鄧 浩,

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計研究所，海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點實驗室，海南 海口 570100；2.海南省食品檢驗檢測中心，國家市場監(jiān)管重點實驗室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），海南 ?？?570314）

蓮霧（[Blume]Merrill &L.M.Perry）又名洋蒲桃、甜霧等，原產(chǎn)于馬來半島，我國臺灣省最早引入。目前，中國臺灣、廣東、海南、廣西、福建、云南、貴州和四川等地均有栽培。蓮霧果實清甜、肉質(zhì)飽滿、水分含量高，具有較高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、糖類、維生素、黃酮和酚酸等。但是，蓮霧果實采后呼吸代謝十分旺盛，果肉易木質(zhì)化而出現(xiàn)絮狀綿軟癥狀，造成品質(zhì)劣變而失去商業(yè)價值。酚酸類物質(zhì)是指同一苯環(huán)上有若干個酚性羥基的一類化合物。酚酸類物質(zhì)在多種酶催化作用下，通過苯丙烷代謝途徑生成木質(zhì)素。酚酸類物質(zhì)包括沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、水楊酸等。它們具有抗氧化、清除自由基、抑菌等生物活性，在保健品和醫(yī)藥上用途廣泛。

酚酸類物質(zhì)是一組復(fù)雜多樣的二級植物代謝物，是木質(zhì)素合成的重要中間產(chǎn)物，分為游離和結(jié)合方式存在于水果中。現(xiàn)有的文獻報道，多以有機溶劑直接萃取，忽略水果中以結(jié)合方式存在的酚酸類物質(zhì)，造成定量不夠準確。酚酸類物質(zhì)的批量分析是開展蓮霧木質(zhì)素代謝和絮狀品質(zhì)劣變研究的基礎(chǔ)。目前，水果中酚酸類物質(zhì)的批量檢測方法有液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。氣相色譜-質(zhì)譜需要對樣品進行衍生化，酚酸類物質(zhì)極性強、活性高，長時間衍生處理會損失而引起較大誤差。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法靈敏度高，不需要衍生，分析時間短，已用于甜櫻桃、梨等水果中用于酚酸類物質(zhì)含量的檢測。關(guān)于蓮霧果實中木質(zhì)素代謝途徑中多種關(guān)鍵酚酸類物質(zhì)的UPLC-MS/MS檢測方法鮮有報道。本研究使用超聲提取方式，優(yōu)化樣品提取液、提取次數(shù)等參數(shù)，能有效提取蓮霧果實中2 種形式存在的酚酸類物質(zhì)。建立的UPLCMS/MS方法用于檢測采后蓮霧果實中7 種關(guān)鍵酚酸類物質(zhì)含量，并構(gòu)建綜合評價模型，旨在為采后蓮霧果實品質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑金剛蓮霧購于?？谑心媳彼l(fā)市場。

沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、異阿魏酸（純度≥98%） 中國食品藥品檢定研究院；水楊酸（純度≥99.8%） 美國First Standard公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙醇（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

4500 三重四極桿質(zhì)譜儀 美國AB 公司；Ultimate 3000超高效液相色譜儀 美國Thermo公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；多管渦旋混合器 德國Heidolph公司；Mettler XS204分析天平 美國Mettler Toledo公司；SCIENTZ-950E 超聲波提取器 寧波新芝生物科技公司；WBL2501B果蔬攪拌機 美的集團股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準工作溶液的配制

稱取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、水楊酸10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL標準儲備溶液；量取適量7 種酚酸類物質(zhì)的標準儲備溶液，配制成質(zhì)量濃度1 000 ng/mL混合標準使用溶液，置于-18 ℃冰箱冷藏保存。

1.3.2 樣品前處理

取15 個大小相近的果，每5 個為一組，共3 組。將5 個蓮霧用果蔬攪拌機處理2 min，稱取經(jīng)攪拌均勻的試樣5.0 g，加入5 mL純水和30 mL乙腈，加入2 粒陶瓷均質(zhì)子，旋渦10 min，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min；取上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。用30 mL乙腈重復(fù)提取1 次，合并上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸近干，用10%乙腈溶液（含0.2%甲酸）溶解殘渣，并定容至10 mL，過0.22 μm有機濾膜，上機測定。3 組平行樣品，經(jīng)檢測后計算平均值。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：CORTECST3（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相A：0.2%甲酸溶液；流動相B：乙腈；柱溫30 ℃；進樣量5.0 μL，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～2 min，95% A，5% B；2～5 min，95%～70% A，5%～30% B；5～9.5 min，70%～10% A，30%～90% B；9.5～10 min，10%～95% A，90%～5% B；10～15 min，95% A，5% B。

質(zhì)譜：電子電離源，負離子模式；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式；噴霧電壓-4 500 kV；離子源溫度550 ℃；霧化氣壓力50 psi；加熱氣壓力50 psi；氣簾氣壓力25 psi；碰撞室入口電壓-10 V。優(yōu)化后7 種酚酸類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7 種酚酸類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of seven phenolic acids

1.3.4 蓮霧采后貯藏及檢測

蓮霧采后于20 ℃貯藏，每間隔2 d用所建立的UPLCMS/MS方法檢測酚酸類物質(zhì)。每次取15 個果分為3 組，每組5 個果按1.3.2節(jié)方法進行前處理，重復(fù)檢測3 次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復(fù)測量3 次，實驗數(shù)據(jù)采用SPASS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，用OriginPro 2019b進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱及流動相的篩選

對比Waters CORTECST3（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Phenomenex KinetexC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Agilent Eclipse Plus C（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3 款色譜柱對7 種酚酸類物質(zhì)的分離效果。經(jīng)對比，由于沒食子酸與C柱鍵合度差，造成其在C柱上保留時間較短，使沒食子酸的響應(yīng)較差，峰形有拖尾現(xiàn)象。C柱對7 種酚酸類物質(zhì)的響應(yīng)不及T3柱；T3色譜柱的目標化合物總離子色譜圖如圖1所示，其分離效果及響應(yīng)最好。馬帥等同樣采用T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）測定花椰菜和西蘭花樣品中23 種酚酸類物質(zhì)，分離效果較好，這和本實驗結(jié)果一致。因此，選擇Waters CORTECST3色譜柱進行后續(xù)UPLC-MS/MS參數(shù)優(yōu)化。

圖1 Waters CORTECS? T3總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of seven phenolic acids separated on T3 column

對比0.1%甲酸-甲醇、10 mmol/L乙酸銨-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-乙腈4 種不同流動相體系對7 種酚酸類物質(zhì)的分離及響應(yīng)效果。結(jié)果表明，2 種含乙腈的流動相對大部分酚酸類物質(zhì)的分離效果及色譜峰形均較好。同時，流動相體系中添加一定量的甲酸或乙酸，能夠減少酚酸類物質(zhì)發(fā)生電離，減少色譜峰形拖尾變寬且不對稱的情況。經(jīng)綜合對比，0.1%甲酸-乙腈的色譜峰形、信號響應(yīng)、穩(wěn)定性最優(yōu)。據(jù)文獻報道，采用乙酸-甲醇、乙酸-乙腈、甲酸-甲醇、甲酸-乙腈作為流動相進行酚酸類物質(zhì)的檢測，在不同儀器不同色譜柱上表現(xiàn)均較好。這和本實驗結(jié)果一致。

2.2 樣品提取液及提取次數(shù)的篩選

分別將30 mL甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、正己烷與5 mL水混合作為提取液，對比了7 種酚酸類物質(zhì)的提取效果。如圖2所示，使用正己烷-水作提取液無回收率，表現(xiàn)最差。說明7 種酚酸類物質(zhì)在正己烷-水中溶解度最差，不適合作為提取液。乙酸乙酯-水作提取液對綠原酸回收率僅為65.3%，乙腈-水對7 種酚酸類物質(zhì)的整體提取效果最好，回收率為85.7%～121.4%。張峰等采用60%甲醇-水提取大蒜中16 種多酚類物質(zhì)，回收率為80%～120%，但沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、水楊酸均未檢出。因此，選擇乙腈-水作為提取液。

圖2 樣品提取液對7 種酚酸類物質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the recoveries of seven phenolic acids

按照1.3.2節(jié)對樣品進行前處理，并采用乙腈-水分別對樣品提取1、2、3 次，以回收率評價提取效果。結(jié)果如圖3所示，乙腈-水對蓮霧中酚酸類物質(zhì)提取3 次后，沒食子酸和咖啡酸的回收率分別提高至108.9%、109.5%。提取2 次各酚酸類物質(zhì)的回收率更接近100%，且提取次數(shù)過多還會增加誤差和雜質(zhì)的干擾風險。因此，為減少誤差，提高提取工作效率，選擇提取2 次。

圖3 提取次數(shù)對7 種酚酸類物質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effect of number of extraction cycles on the recoveries of seven phenolic acids

2.3 線性范圍、檢出限、定量限、精密度、平均回收率結(jié)果

采用優(yōu)化好的UPLC-MS/MS參數(shù)進行方法學研究。以7 種酚酸類物質(zhì)的質(zhì)量濃度（）為橫坐標，峰面積（）為縱坐標，建立標準曲線，如表2所示，7 種酚酸類物質(zhì)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍為5.0～1 000 ng/mL，相關(guān)系數(shù)不小于0.996 1。以信噪比不小于3計算檢出限，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、水楊酸的檢出限分別為0.3、0.6、1.8、2.7、0.3、1.2、0.3 μg/kg；以信噪比不小于10計算定量限，定量限分別為1.0、2.0、5.0、5.0、1.0、5.0、1.0 μg/kg。

表2 7 種酚酸類物質(zhì)的線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率Table 2 Linear equations,limits of detection and quantification,and recoveries of seven phenolic acids

NY/T 3290—2018《水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的測定 液質(zhì)聯(lián)用法》中HPLC-MS/MS法對沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、水楊酸檢出限分別為26、25、19、34、27、38、36 μg/kg。本方法檢出限均低于此標準，說明本檢測方法靈敏度較高。對質(zhì)量濃度為100.0 ng/mL的7 種酚酸類物質(zhì)的標準溶液重復(fù)測定6 次，該方法的相對標準偏差（=6）為1.9%～7.5%，說明儀器具有良好的精密度。將7 種目標化合物添加到空白蓮霧樣品中，進行50、100、200 μg/kg 3 個水平的添加回收實驗，每個水平取6 個平行樣，3 個水平的各酚酸類物質(zhì)平均回收率為93.6%～98.8%，說明本方法回收率較好。

2.4 采后蓮霧果實中7 種酚酸類物質(zhì)含量的檢測

通過本研究建立的UPLC-MS/MS方法對采后蓮霧果實中7 種酚酸類物質(zhì)含量進行測定。本方法未檢出綠原酸。其他6 種酚酸類物質(zhì)含量如表3所示。第0天，蓮霧果實中酚酸類物質(zhì)含量為沒食子酸＞香草酸＞水楊酸＞阿魏酸＞異阿魏酸＞咖啡酸。在采后貯藏0～4 d內(nèi)，蓮霧果實中的沒食子酸、水楊酸含量隨著貯藏時間的延長而增加，在貯藏第4天達到最高值，貯藏4 d后則下降。蓮霧果實中的阿魏酸含量在采后貯藏0～6 d內(nèi)增加，在貯藏第6天達到最高值，貯藏6 d后則下降。上述結(jié)果與王斌和Elmasta?等在其他水果上的檢測結(jié)果類似。異阿魏酸在貯藏期間，持續(xù)增加。咖啡酸和香草酸呈現(xiàn)波動式變化的趨勢。大量研究表明，酚酸類物質(zhì)因具有抗氧化活性，能清除果實貯藏期間產(chǎn)生的自由基。因此，7 種酚酸在貯藏期間動態(tài)變化推測可能與自由基清除有關(guān)。

表3 蓮霧中酚酸類物質(zhì)在貯藏中的變化Table 3 Contents of phenolic acids in wax apple fruit during storage

2.5 酚酸類化合物主成分分析（principal component analysis，PCA）

PCA用于綜合評價6 種酚酸類物質(zhì)在蓮霧果實貯藏過程中的變化。如圖4所示，6 個酚酸類物質(zhì)指標共得到3 個PC：PC1特征值為2.72，貢獻率為45.3%；PC2特征值為1.45，貢獻率為25.0%；PC3特征值為1.16，貢獻率為19.4%。3 個PC累計貢獻率達89.7%，可以共同代表6 種酚酸類物質(zhì)的含量及變化趨勢。將各酚酸類物質(zhì)含量進行標準化處理，以所占總貢獻率的比例、、為權(quán)數(shù)，構(gòu)建3 種PC的綜合評價模型：

圖4 酚酸類物質(zhì)PCA圖Fig.4 PCA plot of six phenolic acids

=×+×+×

=0.564+0.563+0.511+0.120-0.298+0.563

=0.06+0.130-0.011+0.743+0.639+0.130

=0.251-0.264+0.087-0.183+0.045-0.026

=（45.3/89.7）+（25.0/89.7）+（19.4/89.7）

由表4可知，和主要表現(xiàn)的是由“低-高-低”變化的酚酸類物質(zhì)；主要表現(xiàn)的是由“低-高-低-高”波動式變化的酚酸類物質(zhì)；綜合得分值是對3 個PC的總結(jié)性歸納，表現(xiàn)為“低-高-低”變化趨勢，值在貯藏第6天出現(xiàn)負值，說明其酚酸類物質(zhì)已經(jīng)開始大量分解。酚酸類物質(zhì)因其具備抗氧化活性，與果實酶促褐變、品質(zhì)劣變都有著密切的聯(lián)系。因此，經(jīng)過6 d貯藏，伴隨著酚酸類物質(zhì)的大量分解，推測蓮霧的品質(zhì)可能已發(fā)生了明顯變化。

表4 蓮霧果實中酚酸類物質(zhì)含量標準化值與綜合得分Table 4 Standardized values and comprehensive scores of phenolic acid contents in wax apple fruit

3 結(jié)論

建立同時測定蓮霧果實中7 種酚酸類物質(zhì)的UPLCMS/MS方法。7 種酚酸類物質(zhì)在5.0～1 000 ng/mL范圍呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不小于0.996 1，加標回收率為93.6%～98.8%，相對標準偏差為1.9%～7.5%，檢出限為0.3～2.7 μg/kg，定量限為1.0～5.0 μg/kg。使用該方法，對貯藏10 d期間的蓮霧果實中酚酸類物質(zhì)進行分析，驗證其可靠性。經(jīng)PCA獲得了3 個PC和相應(yīng)數(shù)學評價模型。發(fā)現(xiàn)采后第6天，蓮霧果實中酚酸類物質(zhì)大量分解。該方法前處理簡單，靈敏度高，可為蓮霧果實采后酚酸物質(zhì)檢測提供參考。