陳俊男　李治樺　賴琳英　周桂文　梁黎明　陳敏亮

[摘要]目的：本研究旨在觀察乳糜化脂肪來源干細胞條件培養(yǎng)液（Chyle fat derived stromal/stem cells-conditioned medium，CFSCs-CM）對增生性瘢痕成纖維細胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HSFbs）在細胞增殖、凋亡等的影響，為乳糜化脂肪改善增生性瘢痕奠定實驗基礎。方法：采用酶消化法從健康人腹部抽吸脂肪中獲得CFSCs，制備CFSCs-CM用于處理HSFbs，采用CCK-8法、細胞劃痕實驗、Annexin V-FITC凋亡檢測法比較不同培養(yǎng)液對HSFbs細胞增殖、遷移、凋亡的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗、蛋白免疫印記實驗檢測Ⅰ型膠原蛋白（Col Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（Col Ⅲ）、核心蛋白聚糖（Decorin，DN）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的分泌水平。結果：本實驗結果初步驗證CFSCs-CM能夠抑制HSFbs的增殖、遷移，促進凋亡。CFSCs-CM還可以抑制HSFbs分泌Col Ⅰ，Col Ⅲ及α-SMA蛋白。CFSCs-CM對HSFbs能夠發(fā)揮抗纖維化作用。結論：CFSCs-CM可能通過旁分泌途徑來發(fā)揮抑制HSFbs的作用。

[關鍵詞]增生性瘢痕;纖維化;脂肪來源干細胞;機制研究;條件培養(yǎng)液;成纖維細胞

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）10-0001-05

Study on the Mechanism of Chyle Fat Derived Stem Cells Affecting Hypertrophic Scars

CHEN Jun-nan1，LI Zhi-hua1，LAI Lin-ying2，ZHOU Gui-wen2，LIANG Li-ming2，CHEN Min-liang2

[1.PLA Rocket Force Characteristic Medical Center，Beijing 100088，China;2.Department of Burn and Plastic Surgery，the Fourth Medical Centre，Chinese PLA （Peoples Liberation Army） General Hospital，Beijing 100048，China]

Abstract： Objective? The purpose of this study was to observe the effects of CFSCs-conditioned medium （CFSCs-CM） on hypertrophic scar fibroblasts （HSFbs） on cell proliferation and apoptosis. Lay an experimental foundation for the application of chyle fat to improve hypertrophic scars. Methods? Enzymatic digestion method was used to obtain CFSCs from the abdomen of healthy people. CFSCs-CM was used to treat HSFbs. CCK-8， cell scratch test， Annexin V-FITC apoptosis detection were used to compare the effects of different culture media on HSFbs cells The effects of proliferation， migration， and apoptosis. ELISA and Western Blot were used to detect the secretion level of type Ⅰ collagen （Col Ⅰ）， type Ⅲ collagen （Col Ⅲ）， decorin （DN） and α smooth muscle actin （α-SMA）. Results? The results of this experiment preliminarily verify that CFSCs-CM can inhibit the proliferation and migration of HSFbs， and can promote the apoptosis of HSFbs. In addition， CFSCs-CM can also inhibit HSFbs to secrete Col Ⅰ， Col Ⅲ and α-SMA protein. CFSCs-CM can exert anti-fibrosis effect on HSFbs. Conclusion? CFSCs-CM may inhibit HSFbs through the paracrine pathway.

Key words： hypertrophic scar; fibrosis; adipose derived stem cells（ADSCs）; mechanism research; conditioned medium; fibroblast

間充質干細胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）可通過其多向分化潛能及分泌功能調節(jié)免疫反應、促進血管再生，MSCs可以分泌多種具有抗纖維化作用的細胞因子促進創(chuàng)面愈合并減少瘢痕的形成[1-4]，其中脂肪源性間充質干細胞更具備了促進血管內皮細胞增殖，加快血液循環(huán)建立，為瘢痕的修復提供充足的營養(yǎng)及氧，有效改善瘢痕重塑，讓更多的研究者關注其對瘢痕的改善作用[5-6]。筆者前期開展的自體乳糜化脂肪對人增生性瘢痕組織影響的臨床研究，觀察發(fā)現(xiàn)乳糜化脂肪對瘢痕具有良好的治療效果[7]。無獨有偶，通過建立人增生性瘢痕裸鼠移植動物模型，觀察乳糜化脂肪注射后瘢痕的一系列轉歸，亦發(fā)現(xiàn)瘢痕發(fā)生改善。前期實驗結果初步表明，乳糜化脂肪能夠顯著改善瘢痕質地，再次驗證Tonnard[8]、Semra[9]觀點，認為乳糜化脂肪的抗瘢痕作用與乳糜化脂肪來源基質/干細胞（Chyle fat derived stromal/stem cells，CFSCs）密切相關。

上述臨床、基礎研究掀開了瘢痕治療的新篇章，也讓更多的研究者嘗試將脂肪注射應用在瘢痕的治療之中，并探索其機制。脂肪來源干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）對人增生性瘢痕來源成纖維細胞（Human hypertrophic scar fibroblast，hHSFbs）的影響及其潛在機理仍在探索中。本次實驗目的：從分子層面，研究CFSCs對hHSFbs生物學行為（如細胞增殖，遷移潛能和蛋白分泌水平等）的影響，對ADSCs抗纖維化及抗瘢痕形成的具體機制進行初步驗證。

1? 材料和方法

1.1 CFSCs的分離與培養(yǎng)：取下腹部脂肪抽吸手術健康女性患者顆粒脂肪約50ml，將其通過0.5mm孔徑無菌濾網(wǎng)過濾、收集，后經(jīng)0.8mm轉換裝置（BD Luer-Lok connector）于兩5ml注射器反復推注30次，直至脂肪呈白色乳糜狀外觀，過濾后即為乳糜化脂肪。分離提取CFSCs步驟均參照Zuk法。將乳糜化脂肪1：1置于0.1% Ⅰ型膠原酶中，37℃水浴振蕩消化lh，加等體積10%胎牛血清終止酶消化，200目細胞篩過濾，3 000rmp離心8min，棄去上層脂肪、上清，沉淀重懸接種于培養(yǎng)瓶后常規(guī)培養(yǎng)，細胞長滿80%時傳代。

1.2 hHSFbs的分離與提?。航M織塊法培養(yǎng)原代細胞，置于lO%胎牛血清培養(yǎng)液中，37℃、5% C02培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。至細胞80%融合后進行傳代。上述取材均得到所有患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 CFSCs-CM的收集：對照組條件培養(yǎng)液（Control group conditioned medium，CG-CM）：無胎牛血清的純DMEM/F12培養(yǎng)基，為空白對照組;CFSCs條件培養(yǎng)液（CFSCs conditioned medium，CFSCs-CM）：選生長狀態(tài)良好的P3代CFSCs，接種于75cm2培養(yǎng)瓶，生長至80%～90%融合時，換成無血清培養(yǎng)液DMEM/F12 15ml，培養(yǎng)2d后，收集上清液（CFSCs-CM），上清液0.22μm濾膜過濾，分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

1.4 CFSCs-CM對hHSFbs的處理：選擇生長狀態(tài)良好的P3代hHSFbs以1×105細胞/孔接種于6孔培養(yǎng)皿中無血清培養(yǎng)，待達到生長密度及狀態(tài)要求時，更換CG-CM或CFSCs-CM，每孔接種1ml，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，對兩種培養(yǎng)液作用的細胞分別檢測。

1.5 hHSFbs細胞增殖狀況檢測：用CCK-8染色法檢測細胞增殖狀況。取對數(shù)生長期的hHSFbs，以2×103細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗共兩塊96孔板，按分組加無血清培養(yǎng)基，1塊更換為CG-CM培養(yǎng)液，1塊更換為CFSCs-CM培養(yǎng)液，觀察時間點為1d、2d、3d、4d、5d，每個時間點每組6復孔，每孔加入100μl 10% CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2h，用酶標儀測在450nm波長下的吸光度值（OD值）。

1.6 hHSFbs遷移的測定-體外細胞劃痕法：將兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的hHSFbs，按照5×105細胞/孔接種于6孔板中，共兩個培養(yǎng)板，兩組各6復孔;鋪板24h后細胞單層融合達100%;用無菌200μl槍頭（PipetTipFinder，Knoxville，TN，USA）在培養(yǎng)板底部劃痕，建立細胞損傷模型，然后用PBS沖洗吸棄殘留細胞及死細胞，再按組更換CG-CM或CFSCs-CM，放進37℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫孵育，在倒置顯微鏡下（40×）照相，分別選時間點0h、24h、48h測量，用細胞遷移距離表示細胞遷移能力（率）：細胞遷移率（%）=（Gap24h或Gap48h-Gap0h）/Gap0h×100%。

1.7 細胞凋亡的檢測：用Annexin V-FITC（BD PharMingen，556547，USA）雙標記法分析細胞凋亡率。兩組各接種2×105 hHSFbs于6個25cm2培養(yǎng)瓶，各組重復3次。所得數(shù)據(jù)經(jīng)FlowJo軟件分析，于流式細胞儀上進行細胞凋亡情況分析。

1.8 ELISA法：CFSCs-CM、CG-CM兩組的hHSFbs各于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24h收集兩組的培養(yǎng)上清液，進行Col Ⅰ、Col Ⅲ、DN、α-SMA的分泌水平檢測，在450nm處測量吸光度OD值。

1.9 蛋白免疫印記實驗（Western blot）：將細胞經(jīng)各組培養(yǎng)液處理，消化下的細胞懸液轉移至離心管中，PBS清洗數(shù)次，加消化酶消化2min，離心，棄上清液，按照試劑盒說明書進行人膠原蛋白Col Ⅰ、Col Ⅲ及α-SMA的酶聯(lián)免疫試驗。

1.10 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間差異比較采用ANOVA分析。當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 CFSCs-CM對hHSFbs增殖的影響：CCK-8染色法檢測hHSFbs的增殖情況，結果顯示：與空白對照組相比，CFSCs-CM處理后的hHSFbs，在1d、3d、5d收集的條件培養(yǎng)液細胞增殖活力顯著降低（P<0.05）。說明在體外條件下，CFSCs-CM能夠抑制hHSFbs的增殖能力。見圖1。

2.2 CFSCs-CM減緩hHSFbs的遷移能力：自hHSFbs細胞劃痕24h后，對細胞遷移情況進行拍照，其結果顯示，空白對照組（77.72±1.70）%劃痕區(qū)被細胞遷移而覆蓋，CFSCs-CM組（67.08±3.10）%劃痕區(qū)被爬滿，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。自hHSFbs細胞劃痕48h后，對照組（86.95±1.10）%區(qū)域被填充，CFSCs-CM組（79.80±3.20）%區(qū)域被覆蓋。差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明當采用CFSCs-CM組培養(yǎng)液時，細胞遷移速度明顯慢于空白對照組。見圖2～3。

2.3 CFSCs對hHSFbs凋亡的影響：流式細胞儀觀察細胞凋亡，與空白對照組相比，CFSCs-CM組hHSFbs發(fā)生早期凋亡、晚期凋亡以及壞死細胞均明顯增加。見圖4。

2.4 CFSCs-CM對hHSFbs的ECM蛋白合成的影響：與空白對照組相比，CFSCs-CM處理hHSFbs 48h后，對hHSFbs合成Col Ⅰ，Col Ⅲ、DN和α-SMA有抑制作用，相關蛋白分泌水平下調，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖5。

2.5 Western Blot檢測hHSFbs細胞 Col Ⅰ蛋白表達： CFSCs-CM作用hHSFbs 48h后，hHSFbs的Col Ⅰ蛋白表達明顯下調，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖6～7。Col Ⅲ及α-SMA蛋白結果未檢測出具有統(tǒng)計學意義的差異。

3? 討論

近年來大量研究證實自體脂肪具有明顯的拮抗組織器官纖維化作用、再生作用，能夠改善皮膚紋理、膚質[10-11]。2013年Tonnard等[8]制備“納米脂肪（Nanofat）”，開創(chuàng)脂肪移植新技術，臨床應用獲得滿意療效。

現(xiàn)在，Nanofat被越來越廣泛地應用于瘢痕和美容治療領域[9，12-13]。據(jù)此筆者在臨床上制備了類Nanofat的乳糜化濃縮物-乳糜化脂肪，前期進行乳糜化脂肪對增生性瘢痕影響的臨床研究，乳糜化脂肪移植后的瘢痕質地得到明顯改善。在之后的動物實驗研究觀察乳糜化脂肪移植后對瘢痕的一系列影響，也發(fā)現(xiàn)瘢痕較前有顯著改善變化[14]。上述前期實驗結果表明，乳糜化脂肪能夠改善瘢痕質地。筆者推測，這種改善源于乳糜化脂肪來源干細胞所發(fā)揮的組織再生與重建功能。

在研究中，先分離、收集乳糜化脂肪來源干細胞條件培養(yǎng)液（CFSCs-CM），并將其作用于增生性瘢痕源性成纖維細胞（hHSFbs），觀察CFSCs-CM對hHSFbs產(chǎn)生的影響。研究結果表明，CFSCs-CM能抑制hHSFbs增殖、遷移，可誘導其凋亡。這些實驗數(shù)據(jù)同Li等[15]的研究結論一致，即CFSCs-CM能夠抑制hHSFbs增殖、遷移等。本實驗結果表明，hHSFbs在CFSCs-CM干預后，細胞表達胞外基質蛋白ColⅠ，Col Ⅲ及α-SMA明顯下降，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這提示CFSCs-CM可以抑制增生性瘢痕成纖維細胞的膠原、纖維化因子的合成。認為上述表現(xiàn)是通過細胞水平的旁分泌效應強化了CFSCs對hHSFbs的影響。體外實驗CFSCs-CM抑制hHSFbs增殖和膠原蛋白表達，及CFSCs-CM顯著下調α-SMA水平（增生性瘢痕生物活性標志物），證實CFSCs-CM能夠抑制增生性瘢痕中的肌成纖維細胞轉化及抗纖維化作用。

綜上所述，本研究證實CFSCs-CM在體外實驗中，CFSCs有針對增生性瘢痕的抗纖維化作用，是介導改善瘢痕性狀及質量的關鍵細胞。推測可能是因為CFSCs上清液中含有較多的趨化因子和生長因子，通過旁分泌作用減少構成增生性瘢痕ECM結構膠原蛋白的合成，并促進增生性瘢痕來源成纖維細胞的凋亡，繼而發(fā)揮抗瘢痕作用。這也為以后有效運用CFSCs及CFSCs-CM抑制瘢痕提供可靠的實驗基礎。但CFSCs-CM中含有諸多細胞因子、外泌體等介質，到底是何種因子在瘢痕的抑制過程中發(fā)揮著關鍵作用，這些因子之間以及因子與細胞之間是否存在著相互影響，尚有待進一步研究。

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[收稿日期]2020-11-13

本文引用格式：陳俊男，李治樺，賴琳英，等.脂肪源性干細胞影響增生性瘢痕的機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2021，30（10）：1-5.