馬 釗，田春花，楊梅芳，吳 陽(yáng)，金 秋，馬鴻云

（1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院，北方民族大學(xué)合作辦學(xué)醫(yī)院，銀川750002；2.寧夏回族自治區(qū)銀川市婦幼保健院，銀川750002）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率、病死率居女性惡性腫瘤首位，且呈年輕化趨勢(shì)，約14%的患者發(fā)病時(shí)處于育齡期，其中約70%的患者仍有生育意愿[1-4]。以孕激素為基礎(chǔ)的保育治療方案為年輕且有生育要求的EC患者提供了臨床選擇[5-7]。但約有30%的患者對(duì)孕激素治療產(chǎn)生耐藥，這與孕激素激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路產(chǎn)生孕激素抵抗有關(guān)[8-9]，也為年輕早期EC患者保留生育功能治療帶來(lái)困難[10]。研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）參與EC的發(fā)生、發(fā)展。韓振坤等[14]發(fā)現(xiàn)，在EC組織中miR-21呈高表達(dá)，且與癌組織的惡性程度呈正相關(guān)，這與Lai、王淑芳等[15-16]研究結(jié)果一致。因此推測(cè)，拮抗miR-21表達(dá)可能具有抑癌作用。文章旨在探究miR-21拮抗劑聯(lián)合左炔諾酮對(duì)EC Ishikawa細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為年輕早期EC患者制訂保留生育功能治療的新方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)使用人EC細(xì)胞株Ishikawa，細(xì)胞株購(gòu)買自北納生物公司（BNCC338359）。

1.2 試劑與儀器

完全DMEM培養(yǎng)基（KGM12800S-500，凱基生物）；Lipofectamine ? 3000 Transfection Reagent（L3000015，invitrogenTM）；miR-21拮抗劑（中洪博元分子實(shí)驗(yàn)室提供）；左炔諾孕酮（LNG）（S1727，Selleckchem）：50 mg HCY干粉中加入1.6 mL DMSO溶解，得100 mmol·L-1母液，-20℃分裝保存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求劑量進(jìn)行稀釋；CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（KGA317，凱基生物）；Anti-PTEN antibody［EPR9941-2］（ab170941，Abcam）；辣根酶標(biāo)記二抗［山羊抗兔IgG（H+L）（親和純化）（ZB-2301）中杉金橋］；DAB顯色試劑盒（CW0125，CWBIO康為世紀(jì)）；中性樹(shù)脂（CW0136，CWBIO康為世紀(jì)）；蘇木素染色（AR1180-1，博德生物）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES聯(lián)科生物）；結(jié)晶紫染色液（G1061，Solarbio）；miRNA cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（CW2141S，CWBIO康為世紀(jì)）；miRNA qPCR Assay Kit（CW2142S，CWBIO康為世紀(jì)）；miRNA Purification Kit提取試劑盒（CW0627S，CWBIO康為世紀(jì)）；Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO康為世紀(jì)）；Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO康為世紀(jì)）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（CW2569M，CWBIO康為世紀(jì)）；UltraSYBR Mixture（CW0957M，CWBIO康為世紀(jì)）；RIPA細(xì)胞裂解液（C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）（CW0014S，康為世紀(jì)）；內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2 000）；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（ZB-2305，中杉金橋，1/2 000）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-AKT（ab8805，Abcam，1/500）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-P-AKT（bs-2720R，Bioss，1/500）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-PI3K（bs-0128R，Bioss，1/500）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-P-PI3K（AF3241，Affinity，1/1 000）；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金橋，1/2 000）；倒置熒光顯微鏡（MF53，廣州市明美光電有限公司）；多功能酶標(biāo)分析儀（SAFIREII，TECAN瑞士帝肯）；離心機(jī)（TD4A，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1600PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司）；蛋白垂直電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠）；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)［Chemi DocTMXRS+，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］；EDTA胰蛋白酶消化液（T1300 Solarbio）；離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16D，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；Annexin V-FITC（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES聯(lián)科生物）；十二烷基苯磺酸鈉凝膠（151-21-3，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 采用完全DMEM培養(yǎng)基在濕度飽和37℃、5% CO2常規(guī)條件的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為Ishikawa組（Control組）；Ishikawa+LNG處理組（LNG組）；Ishikawa+LNG+miR-21拮抗劑處理組（LNG+miR-21組）；Ishikawa+LNG+miR-21無(wú)關(guān)序列處理組（LNG+NC組）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞以106個(gè)/孔接種至6孔細(xì)胞板上，待細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)轉(zhuǎn)染，前一天接種或換液，取出RNA干粉離心3 000 r·min-1，5 min；使用Opti-MEMR培養(yǎng)基稀釋LipofectamineR 3000試劑充分混勻，避光室溫孵育5 min。在每管已稀釋的Lipofectamine R 3000試劑中加入稀釋的RNA中混勻，室溫避光孵育1 h。按照上述分組，加入RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物至細(xì)胞中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞凋亡 棄Ishikawa細(xì)胞株上清液，每孔1 mL PBS潤(rùn)洗2遍，加200 μL含螯合劑（EDTA）胰蛋白酶消化液，放入37℃培養(yǎng)箱，當(dāng)Ishikawa細(xì)胞消化后，用含血清的完全培養(yǎng)基終止子宮內(nèi)膜細(xì)胞消化、吹散后收集Ishikawa細(xì)胞懸液。將Ishikawa細(xì)胞懸液在2 500 r·min-1離心3 min并棄上清液。加1 mL PBS后再2 500 r·min-1，離心3 min后棄Ishikawa細(xì)胞上清液，每管加PBS 300 μL混勻后再加5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），輕混勻后，待室溫避光孵育10 min后上機(jī)。

1.3.3 CCK-8檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞增殖 將Ishikawa細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)、鋪96孔板（細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔），待EC細(xì)胞貼壁后，按照分組進(jìn)行相應(yīng)處理，處理24 h向待測(cè)板中每孔加入10 μL CCK-8反應(yīng)2 h，分別采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm吸光處檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率（%）=［A（實(shí)驗(yàn)組）-A（空白培養(yǎng)基）］/［A（對(duì)照組）-A（空白培養(yǎng)基）］×100%[17]。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞侵襲力 將Ishikawa細(xì)胞消化收集后離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并且計(jì)數(shù)，使每個(gè)小室細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè)；在小室加入500 μL完全培養(yǎng)基，上室細(xì)胞與無(wú)血清培養(yǎng)基總體積約300 μL；48 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。去除各孔中的培養(yǎng)基，然后加入PBS清洗5 min，加配好的0.1%結(jié)晶紫染色1 h，染完后擦去小室的內(nèi)室細(xì)胞，之后將小室倒置拍照，拍照完成后去除孔中的染色液，在每個(gè)孔中加入配制好的33%乙酸（取33 mL 100%乙酸加到67 mL純水中，混勻）2 mL溶解細(xì)胞中的染液，充分混勻靜置后，用分光光度計(jì)，以波長(zhǎng)為570 nm，用33%乙酸調(diào)零，測(cè)定每孔中的溶液的吸光值，平行3次。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞遷移力 待Ishikawa細(xì)胞鋪板密度達(dá)到90%以上后進(jìn)行細(xì)胞劃痕，使用200 μL槍頭在每孔進(jìn)行劃痕，棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，換成無(wú)血清培養(yǎng)基后給每孔劃痕拍照；將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，24 h后再次給每孔的劃痕拍照。測(cè)量細(xì)胞劃痕寬度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的遷移速率，細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%[18]。

1.3.6 Western blot檢測(cè)各組PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)Ishikawa細(xì)胞中加入裂解液，裂解30 min后，4℃下10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，可得總蛋白。根據(jù)蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BCA）測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。一抗溶液孵育，4℃過(guò)夜；二抗溶液室溫孵育1～2 h。在膜上滴加超敏化學(xué)發(fā)光液（ECL）曝光液后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 確定LNG最佳作用濃度和時(shí)間

在LNG作用24 h，細(xì)胞凋亡率隨著濃度增加升高（P＜0.05），尤其100 μmol·L-1濃度凋亡率最高。并且細(xì)胞在10、50和100 μmol·L-1濃度時(shí)存活率均降低（P均＜0.05），尤其100 μmol·L-1濃度凋亡率最高、存活率最低。因此以下實(shí)驗(yàn)選擇LNG的濃度為100 μmol·L-1，作用時(shí)間為24 h，見(jiàn)圖1。

圖1 確定LNG最佳作用濃度和時(shí)間

2.2 各組細(xì)胞凋亡率、侵襲力、遷移力及增殖率比較

與Control組相比，LNG+NC組和LNG+miRNA-21組的凋亡率均升高（P均＜0.05）；與Control組相比，LNG+miRNA-21組的侵襲和遷移能力均降低（P均＜0.05）；LNG、LNG+NC組和LNG+miRNA-21組的增殖能力均降低（P均＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理方法對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

2.3 PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)

與Control組相比，LNG組和LNG+miR-21組PTEN、AKT、PI3K蛋白表達(dá)升高，p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)均降低（P均＜0.05）；與Control組相比，LNG+NC組PTEN、AKT、PI3K蛋白表達(dá)升高，p-AKT、p-PI3K基因表達(dá)降低（P均＜0.05），見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖4 PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

單獨(dú)應(yīng)用孕激素或聯(lián)合宮腔鏡病灶切除是年輕早期EC患者最常用、最有效的保留生育能力的治療方案[1，4-5，19]。但是長(zhǎng)期使用孕激素治療可以導(dǎo)致ECPR表達(dá)下降，即產(chǎn)生耐藥性；有研究發(fā)現(xiàn)，在PR陰性表達(dá)或低表達(dá)EC細(xì)胞中，孕激素可激活PI3K/AKT通路產(chǎn)生孕激素抵抗[8]，從而使患者對(duì)孕激素治療不敏感，這為年輕患者保留生育功能臨床治療帶來(lái)巨大困難[10]。針對(duì)孕激素抵抗機(jī)制的靶向治療可能逆轉(zhuǎn)孕激素抵抗，應(yīng)用孕激素聯(lián)合靶向治療可能成為有生育要求的EC患者治療的新手段。

miRNA屬于內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其可通過(guò)5’-種子區(qū)與調(diào)控一個(gè)或多個(gè)靶基因miRNA的3’-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)調(diào)控靶基因表達(dá)，從而起到類似抑癌或促癌基因的作用[20-21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EC細(xì)胞內(nèi)存在多種miRNA表達(dá)異常，這提示miRNA可能參與了EC的發(fā)生與發(fā)展[11-12]。miR-21是miRNA的一種，在EC患者血清、癌組織中均見(jiàn)miR-21高表達(dá)，且其表達(dá)的程度與淋巴轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)[15]，這提示miR-21可能參與了EC的發(fā)生、發(fā)展。Gao、秦曉燕等[22-23]的研究證實(shí)了上述觀點(diǎn)。這為臨床上子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供依據(jù)。

目前學(xué)者公認(rèn)的PTEN可以抑制EC的發(fā)生、發(fā)展，多數(shù)EC的發(fā)生與PTEN功能的缺失有關(guān)[24]，在最常見(jiàn)的EC亞型中，80%的EC都有PTEN突變[25]。miR-21在EC中過(guò)表達(dá)，miR-21可以下調(diào)PTEN的表達(dá)水平，從而促進(jìn)EC的細(xì)胞增殖[26]。

本研究結(jié)果顯示，與其他組相比，LNG+miR-21組采用100 μmol·L-1LNG聯(lián)合miR-21拮抗劑處理EC Ishikawa細(xì)胞，其增殖率、遷移和侵襲能力最低，而細(xì)胞凋亡率最高。這說(shuō)明LNG聯(lián)合miR-21拮抗劑可以抑制EC Ishikawa細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；與其他組相比，LNG+miR-21組EC Ishikawa細(xì)胞的PTEN、AKT、PI3K蛋白表達(dá)最高，而p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)最低，這說(shuō)明miR-21拮抗劑通過(guò)上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，來(lái)抑制PI3K/AKT通路，增強(qiáng)LNG的抗癌作用，從而實(shí)現(xiàn)抑制Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用，最終促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-21拮抗劑聯(lián)合左炔諾孕酮可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的凋亡，抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖，這為年輕早期EC患者的臨床治療提供了新的思路。