楊延周，陳敏慧，李可可

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，銀川市第一人民醫(yī)院急診科，銀川750001）

近年來(lái)有研究[1-2]顯示，氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）和適度的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在雌性哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中起著重要的作用，過(guò)多的ROS可引起生殖系統(tǒng)疾病。有研究[3]報(bào)道，生理水平的ROS參與許多的雌性生殖過(guò)程，如卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和排卵。此外，累積的OS和抗氧化劑還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的耗竭引起細(xì)胞凋亡，ROS引起卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡。

動(dòng)情周期是雌性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)特征之一，動(dòng)情周期中激素和生殖器官可發(fā)生節(jié)律性變化[4]，而生殖器官如卵巢和子宮的節(jié)律性變化受類固醇激素的調(diào)控。小鼠血清雌二醇（estrogen，E2）水平在動(dòng)情前期達(dá)到峰值，一直持續(xù)到動(dòng)情期直到排卵，在動(dòng)情后期降低，在間情期維持較低的基礎(chǔ)水平，孕激素（progesterone，P4）的節(jié)律性變化與雌激素相反[5]，此外，動(dòng)情周期中的促乳素也發(fā)生節(jié)律性的變化[6]。近來(lái)的研究[7]發(fā)現(xiàn)，E2與心血管的OS密切相關(guān)，P4與人黃素化的顆粒細(xì)胞功能密切相關(guān)[8]。

盡管OS參與多個(gè)哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程[9-11]，但是OS在雌性哺乳動(dòng)物動(dòng)情周期中的動(dòng)態(tài)變化尚不清楚，動(dòng)情周期OS動(dòng)態(tài)變化是否與類固醇激素的變化相關(guān)也不清楚。因此，本研究主要探究了動(dòng)情周期的OS水平，進(jìn)而為揭示其在雌性小鼠生殖過(guò)程中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步揭示生殖疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6~8周齡ICR雌性小鼠購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)：2020-0001）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在特定的溫度及適度條件下，給予標(biāo)準(zhǔn)的飼料喂養(yǎng)，并且自由飲食，所有的實(shí)驗(yàn)操作程序都嚴(yán)格按照寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。應(yīng)用陰道涂片方法確定小鼠的動(dòng)情周期[12-14]。

1.2 免疫組織化學(xué)

收集小鼠動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期及間情期的輸卵管傘部、壺腹部、峽部和子宮角，并立即固定在4%的多聚甲醛中，24 h后組織經(jīng)脫水、透明及浸蠟處理之后，用石蠟包埋，切片（厚度為6 μm）。石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、脫水之后進(jìn)行抗原熱（96～98℃）修復(fù)20 min，抗原修復(fù)液為0.1 mol·L-1檸檬酸、0.1 mol·L-1檸檬酸鈉和水按9∶41∶450配制。免疫組化程序按相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]及試劑盒說(shuō)明書(shū)（天根生化科技有限公司，北京）操作如下：0.3%過(guò)氧化氫-甲醇處理10 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 mol·L-1PBS液洗片3次，每次5 min，10%山羊血清處理30 min以消除非特異性結(jié)合。然后分別加入兔抗超氧化物歧化酶1（SOD1）（1∶200；abcam，ab183881）和兔抗8-羥基鳥(niǎo)嘌呤DNA糖苷酶1（OGG1）（1∶200；proteintech，15125-1-AP）抗體，4℃過(guò)夜，0.01 mol·L-1PBS洗片3次，每次5 min；加入山羊抗兔二抗，孵育1 h后，0.01 mol·L-1PBS洗片3次，每次5 min；DAB顯色（天根生化科技有限公司，北京），蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察組織顯色情況，棕黃色為陽(yáng)性，即蛋白表達(dá)部位。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量（PCR）實(shí)驗(yàn)

收集小鼠動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期及間情期的卵巢和子宮角，立即加入Trizol提取卵巢和子宮總RNA，RNA提取按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作進(jìn)行。測(cè)定提取的RNA的OD值，并計(jì)算RNA濃度，隨之進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照試劑盒（RR036Q，TaKaRa）操作程序進(jìn)行，10 μL體系包括：5X PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）2 μL，總RNA 500 ng，加無(wú)RNA酶水至10 μL；反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃暫時(shí)保存或直接用于下游qPCR反應(yīng)。熒光定量PCR程序按照試劑盒說(shuō)明書(shū)（RR820A，TaKaRa）進(jìn)行。20 μL體系包括：TB GreenTMPremix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX Reference Dye or DyeⅡ（50×）0.4 μL，滅菌水6 μL，總體積20 μL；反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)及PCR儀采用兩步法：1）預(yù)變性：重復(fù)1個(gè)循環(huán)，95℃30 s；2）PCR反應(yīng)：40個(gè)循環(huán)，95℃5 s，60℃30 s。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期及間情期卵巢和子宮角的OGG1和SOD1蛋白表達(dá)水平應(yīng)用Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法參考本課題組已發(fā)表文章[17]。步驟如下：提取總蛋白后應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床振蕩封閉1 h后，加入稀釋好的兔抗SOD1（1∶1 000；abcam，ab183881）和 兔 抗OGG1（1∶1 000；proteintech，15125-1-AP）抗體，4℃搖床孵育過(guò)夜，應(yīng)用TBST緩沖液洗膜3次（每次15 min），加入稀釋好的山羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h后TBST緩沖液振蕩沖洗3次（每次15 min）。最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermol，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上加入適量發(fā)光液曝光。Western blot條帶灰度值應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)每個(gè)組至少重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動(dòng)情周期不同階段子宮角和輸卵管SOD1免疫組化結(jié)果

SOD1蛋白主要定位于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細(xì)胞，定位于輸卵管上皮細(xì)胞。間情期子宮角SOD1呈現(xiàn)高陽(yáng)性表達(dá)，動(dòng)情前期有弱陽(yáng)性表達(dá)，動(dòng)情期和動(dòng)情后期無(wú)陽(yáng)性。動(dòng)情期所有輸卵管SOD1呈現(xiàn)高陽(yáng)性染色，動(dòng)情期中輸卵管壺腹部比傘部和峽部有更深的染色，在動(dòng)情前期和動(dòng)情后期輸卵管傘部、峽部有弱陽(yáng)性，壺腹部無(wú)陽(yáng)性，間情期無(wú)陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠動(dòng)情周期子宮角和輸卵管傘部、峽部和壺腹部SOD1的免疫組化結(jié)果（×400）

2.2 小鼠動(dòng)情周期不同階段子宮角和輸卵管OGG1免疫組化結(jié)果

OGG1蛋白定位與SOD1一致。OGG1在動(dòng)情前期子宮角有弱陽(yáng)性表達(dá)，間情期有較高陽(yáng)性的表達(dá)，動(dòng)情期和動(dòng)情后期呈陰性染色。OGG1在動(dòng)情期所有輸卵管呈現(xiàn)高陽(yáng)性染色，但是在輸卵管傘部有更深的染色，動(dòng)情前期和動(dòng)情后期的OGG1染色呈陰性，而在間情期輸卵管壺腹部和峽部有較弱的染色，在傘部觀察不到染色，見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠動(dòng)情周期子宮角和輸卵管傘部、峽部和壺腹部OGG1的免疫組化結(jié)果（×400）

2.3 小鼠動(dòng)情周期不同階段血清中OS指標(biāo)

ELISA方法檢測(cè)動(dòng)情周期血清中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）、丙二醛（MDA）、GSH和超氧化物歧化酶（SOD）的水平。結(jié)果顯示：動(dòng)情期血清中8-OHdG和MDA的含量高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；動(dòng)情前期的GSH含量高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），SOD在動(dòng)情周期的各個(gè)階段差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

圖3 ELISA方法檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期不同階段血清中的OS指標(biāo)

2.4 小鼠動(dòng)情周期不同階段卵巢和子宮角組織中SOD1和OGG1基因水平表達(dá)

PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期不同階段卵巢和子宮角中SOD1和OGG1的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示動(dòng)情期卵巢、子宮角中SOD1和OGG1的mRNA水平低于間情期（P均＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期不同階段卵巢和子宮角中SOD1和OGG1的mRNA表達(dá)

2.5 小鼠動(dòng)情周期不同階段卵巢和子宮角組織中SOD1和OGG1蛋白表達(dá)的結(jié)果

Western blot檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期不同階段卵巢和子宮角中SOD1和OGG1的蛋白表達(dá)，SOD1和OGG1在卵巢、子宮角組織中的蛋白表達(dá)情況與PCR結(jié)果一致，動(dòng)情期SOD1和OGG1蛋白水平低于間情期（P均＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期不同階段卵巢和子宮角中SOD1和OGG1的蛋白表達(dá)

3 討論

OS是由于機(jī)體ROS產(chǎn)生過(guò)多，從而造成氧化/抗氧化失衡的狀態(tài)。而機(jī)體促氧化與抗氧化失衡可導(dǎo)致許多生殖疾病，如子宮內(nèi)膜炎、多囊卵巢綜合征及一些不明原因的不孕[18]，但是正常動(dòng)情周期中的OS水平如何變化尚不清楚。正常小鼠動(dòng)情周期中OS標(biāo)記物MDA、8-OHdG以及抗氧化標(biāo)記物SOD和GSH在動(dòng)情周期不同階段血清中的表達(dá)規(guī)律如何變化亦不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，MDA、8-OHdG、SOD、GSH廣泛地表達(dá)于小鼠動(dòng)情周期的各個(gè)階段，證明正常小鼠卵巢組織中OS狀態(tài)和抗氧化防御系統(tǒng)存在于動(dòng)情周期的各個(gè)階段，在動(dòng)情期高水平表達(dá)的8-OHdG和MDA說(shuō)明在動(dòng)情期OS水平最高。而出現(xiàn)這種高水平的OS狀態(tài)可能與正常小鼠卵巢組織中生殖活動(dòng)及相關(guān)疾病有關(guān)[19]。且動(dòng)情周期中的OS變化規(guī)律可能與雌激素、孕激素的變化密切相關(guān)。的確，許多研究證實(shí)雌激素、孕激素參與調(diào)節(jié)OS及ROS[20]。

SOD是抗氧化酶類，與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)，可保護(hù)卵母細(xì)胞免受損傷。哺乳動(dòng)物中SOD主要有三種亞型：細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD（SOD1）存在于胞質(zhì)中，線粒體Mn-SOD（SOD2）分布于線粒體基質(zhì)，細(xì)胞外CuZn-SOD（SOD3）分布于細(xì)胞外液、局部淋巴、骨液和血漿。但主要以SOD1為主，占90%。因此，本研究主要探究了SOD1在小鼠動(dòng)情周期卵巢、輸卵管及子宮角中的變化規(guī)律。卵泡液中高水平的SOD可有效減輕卵母細(xì)胞及卵丘細(xì)胞中OS導(dǎo)致的DNA損傷，從而使卵母細(xì)胞成功受精。故SOD表達(dá)于正常小鼠動(dòng)情周期的各個(gè)階段，揭示了卵巢組織、細(xì)胞抗OS的存在和SOD的抗氧化保護(hù)作用。GSH是儲(chǔ)存于卵母細(xì)胞中的主要非酶類抗氧化物，其可保護(hù)受精卵及早期胚胎免受OS傷害。相比于未成熟卵母細(xì)胞，成熟的卵母細(xì)胞中含有更高水平的GSH，據(jù)此認(rèn)為高水平GSH是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。GSH在維持細(xì)胞內(nèi)還原狀態(tài)、保護(hù)細(xì)胞免受OS傷害中起重要作用，GSH在細(xì)胞和胚胎中不僅起防御氧化損傷的作用，還發(fā)揮著多種重要作用，如參與DNA合成、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子活化及凋亡過(guò)程，GSH也執(zhí)行多種細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外功能，對(duì)ROS類及外源性物質(zhì)有解毒作用。所以GSH高表達(dá)在正常小鼠卵巢動(dòng)情周期的前期可能與卵母細(xì)胞的成熟、抗氧化保護(hù)作用有關(guān)。因此，OS狀態(tài)及ROS水平的高低在正常小鼠中可能與生殖器官中生理、病理活動(dòng)密切相關(guān)。如促進(jìn)卵母細(xì)胞受精作用；對(duì)卵母細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)有損害和及時(shí)保護(hù)作用；排卵；卵子發(fā)育；卵母細(xì)胞的成熟等。

排卵是一個(gè)復(fù)雜的生殖過(guò)程，也是一個(gè)類炎癥過(guò)程[21]，且受到多種因素的調(diào)控，包括前列腺素、水解酶、細(xì)胞因子、一氧化氮、類固醇激素及ROS。排卵前卵泡的ROS水平被認(rèn)為是誘導(dǎo)排卵的主要因素之一[19]，特別是在排卵的過(guò)程中產(chǎn)生大量的ROS[22]，而排卵發(fā)生在動(dòng)情期，因此，動(dòng)情期高水平的氧化應(yīng)激可能參與排卵過(guò)程。此外，促黃體生成素（LH）脈沖在誘發(fā)排卵過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而LH脈沖過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥因子誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，抑制這些炎癥因子導(dǎo)致排卵失敗。因此，ROS及OS是排卵必不可少的物質(zhì)[23]。ROS水平的升高及抗氧化水平的降低可促進(jìn)排卵[23]。本研究結(jié)果顯示，在子宮角、卵巢中的SOD1和OGG1的mRNA、蛋白表達(dá)水平及輸卵管、子宮角中SOD1和OGG1免疫組化定位，在小鼠動(dòng)情周期中不斷發(fā)生變化，間情期表達(dá)量較高，在動(dòng)情期表達(dá)量較低，提示SOD1和OGG1在動(dòng)情周期中發(fā)揮重要作用。子宮是孕育生命的場(chǎng)所，也是胚胎著床發(fā)生的主要場(chǎng)所，在動(dòng)情期子宮的SOD1具有抗氧化、防衰老、防止細(xì)胞核內(nèi)DNA損傷、調(diào)節(jié)氧等維持正常細(xì)胞活性的重要生理功能，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞、保護(hù)基因組的作用，SOD1也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)及代謝進(jìn)程。所以SOD1在正常小鼠子宮角、卵巢中的表達(dá)規(guī)律與改善OS狀態(tài)以及參與子宮角、卵巢器官中早期胚胎的發(fā)育和保護(hù)組織、細(xì)胞免受損害有關(guān)。OGG1基因?yàn)楣芗一?，在所有的組織器官中均可表達(dá)，OGG1有修復(fù)線粒體DNA損傷的功能，在子宮角、卵巢器官間情期中高表達(dá)，因而推測(cè)正常小鼠動(dòng)情周期的OGG1在維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定及胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，子宮角與輸卵管中SOD1和OGG1的免疫組化定位在小鼠動(dòng)情周期中也不斷發(fā)生變化，SOD1在動(dòng)情期呈高陽(yáng)性表達(dá)，而且在動(dòng)情期壺腹部表達(dá)更高，間情期無(wú)表達(dá)；OGG1也在動(dòng)情期有高陽(yáng)性表達(dá)，在傘部表達(dá)更高，動(dòng)情前期和動(dòng)情后期無(wú)陽(yáng)性。輸卵管是受精和早期胚胎發(fā)育的場(chǎng)所，在動(dòng)情周期不同階段，可能與配子的相互作用和早期胚胎的發(fā)育有關(guān)，SOD1和OGG1這種高表達(dá)揭示正常小鼠動(dòng)情期在OS因素的影響下可能與輸卵管受精和早期胚胎發(fā)育以及保護(hù)受精卵有關(guān)，進(jìn)而引起輸卵管在生化和生理學(xué)上發(fā)生相應(yīng)的變化。

綜上所述，OS水平在小鼠正常的生殖器官動(dòng)情周期的各個(gè)階段是不同的，其表達(dá)范型可能與小鼠的排卵、受精及早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)，且受到雌孕激素的調(diào)控。