王 麗，梁 軍，張 煒，黃 菱，萬巧鳳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川750004）

中藥黃芩富含多種黃酮類化合物，如黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等，其中黃芩苷是其主要活性成分，具有消炎[1]、抗氧化等[2]多種生物學(xué)作用，迄今為止，有關(guān)黃芩苷修復(fù)損傷方面的研究鮮有報道。因前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對流感病毒致肺損傷小鼠具有良好的保護(hù)作用[3]，所以本研究擬以人胚肺成纖維細(xì)胞（MCR-5）為研究對象，以誘導(dǎo)細(xì)胞損傷具有顯著作用的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）為誘導(dǎo)劑，旨在進(jìn)一步探討黃芩苷修復(fù)細(xì)胞損傷的作用及可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

MCR-5購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技研究院。

1.2 藥品

黃芩苷購自南京春秋生物工程有限公司，批號21967-41-9，純度大于98%，用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基（含1/1000 DMSO）將其配制成1 g·L-1的母液，用0.22 μm的濾器過濾除菌，分裝后保存于-20℃。

1.3 試劑

TNF-α（Cyagen，貨號HETNP-01011）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天，貨號C0602）；微小RNA（miRNA）提取試劑盒（QIAGEN公司）；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI公司）；Trizol（Invitrogen公司）；Real-time PCR擴(kuò)增試劑盒（Roche公司）；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）兔抗人抗體（EPitomics，貨號3894-1）；周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）鼠抗人抗體（Abcam，貨號ab54576）；蛋白質(zhì)分子量Marker（Bio-Rad，貨號161-0374）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZB-2301）；GAPDH一抗（Abcam，貨號ab8245）；Western blot其他試劑由本室配備。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞 將MCR-5細(xì)胞用完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 μg·mL-1鏈霉素、100 U·mL-1青霉素及DMEM）培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，傳代3～4次后選狀態(tài)良好的細(xì)胞，以終濃度為10 ng·mL-1的TNF-α進(jìn)行誘導(dǎo)7 d[4]，采用β-半乳糖苷酶染色試劑檢測TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞活性。

1.4.2 β-半乳糖苷酶染色檢測TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞損傷情況 本實驗設(shè)3個組。正常組為未經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞按5×104個/mL接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，加完全培養(yǎng)液；另2組為將TNF-α誘導(dǎo)7 d的MCR-5細(xì)胞接種于6個培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后分為TNF-α誘導(dǎo)組（TNF-α10 ng·mL-1）和黃芩苷處理組（TNFα10 ng·mL-1+黃芩苷100 μg·mL-1），每組3個皿，作用72 h，進(jìn)行細(xì)胞損傷檢測。根據(jù)β-半乳糖苷酶染色試劑盒規(guī)定流程，完成相關(guān)操作后采用顯微鏡觀察，在10倍物鏡下，每組每個皿中隨機拍5個視野，每個視野中計數(shù)50個細(xì)胞，統(tǒng)計損傷細(xì)胞并計算細(xì)胞損傷率。細(xì)胞損傷率（%）=損傷細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%[5]。

1.4.3 RT-qPCR及Western blot實驗分組[6]本實驗細(xì)胞分組及藥物處理同1.4.2所述，每組14個皿。于37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)48 h及72 h后，收集各組細(xì)胞。每個時間點，每組中3個皿用來提取蛋白，另外4個皿用來提取總RNA。1.4.4 RT-qPCR檢測MCR-5細(xì)胞miR-22[6]表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總mRNA，紫外分光光度計定量。反轉(zhuǎn)錄體系（15 μL）：RT Master Mix 7 μL；RNA 5 μL；5×RT primer（150 nmol·L-1）3 μL。條件：16℃30 min；60℃30 min；72℃5 min。引物序列：U6上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，U6下游5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-22上游5’-ATGGTTCGTGCGAAGCTGCCAG TTGAAGAA-3’；miR-22下游5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-22 RT莖 環(huán) 引 物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTG-GATACGACACAGTTCT-3’。Real-Time PCR體系（20 μL）：cDNA 2 μL；引物1和引物2各1 μL（10 pmol·μL-1）；SYBR Mix 10 μL；ddH2O 6 μL。避光置于熒光定量PCR儀（ABI 7500）檢測miR-22表達(dá)，U6作為miR-22內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計算各個樣本目的基因的表達(dá)[7]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.5 Western blot檢測MCR-5細(xì)胞SIRT1及CDK6蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取總蛋白40 μg，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水浴5 min后上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠100 V），半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（30 mA，90 min）；封閉后分別加入SIRT1、CDK6及GAPDH一抗（SIRT1一抗稀釋度為1∶1 000；CDK6為1∶2000；GAPDH一抗為1∶10 000），4℃過夜；TBS-T漂洗液洗膜10 min，共3次；加入HRP標(biāo)記的二抗（SIRT1二抗稀釋度為1∶2 000；CDK6為1∶2 000；GAPDH為1∶5 000），37℃振蕩60 min；加入ECL發(fā)光液，X線膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀察結(jié)果。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件對掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析，各目的條帶與GAPDH的灰度比值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞損傷率的影響

與正常MCR-5細(xì)胞比較，TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞的損傷率升高（P＜0.01）；與TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞比較，黃芩苷處理組細(xì)胞的損傷率降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞損傷率的影響（±s，n=15）

2.2 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞miR-22表達(dá)的影響

與同時間點的正常MCR-5細(xì)胞比較，TNFα誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞miR-22在48 h及72 h表達(dá)水平均升高（P＜0.01）；與同時間點的TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞比較，黃芩苷處理48 h、72 h的miR-22表達(dá)水平均降低（P均＜0.05）。另外，正常組及黃芩苷處理組的兩個時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而TNF-α誘導(dǎo)損傷組兩個時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；說明黃芩苷可有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞miR-22的表達(dá)，見圖2。

圖2 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞miR-22表達(dá)的影響（±s，n=4）

2.3 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響

與同時間的正常MCR-5細(xì)胞比較，TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞組SIRT1蛋白在48 h及72 h表達(dá)水平均降低（P均＜0.01），與同時間TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞組比較，黃芩苷處理48 h及72 h的SIRT1蛋白表達(dá)水平均升高（P均＜0.05）。另外，正常組的兩個時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而TNF-α誘導(dǎo)組及黃芩苷處理組兩個時間點差異明顯（P均＜0.05）。說明黃芩苷可促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)，見圖3。

2.4 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞CDK6蛋白表達(dá)的影響

與同時間點的正常MCR-5細(xì)胞比較，TNFα誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞CDK6蛋白在48 h及72 h表達(dá)水平均降低（P均＜0.01），與同時間點TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞比較，黃芩苷處理48 h、72 h的CDK6蛋白表達(dá)水平均升高（P均＜0.05）。另外，正常組的48 h和72 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而TNF-α誘導(dǎo)組及黃芩苷處理組48 h和72 h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。說明黃芩苷可促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞CDK6蛋白的表達(dá)，見圖4。

圖4 黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞CDK6蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

3 討論

TNF-α是一種重要的炎癥因子，在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老損傷方面作用顯著[8]。過去認(rèn)為細(xì)胞衰老表現(xiàn)為細(xì)胞生長抑制和增殖潛能衰竭，細(xì)胞的表型、結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)生許多不可逆的改變[9]。近期有研究表明衰老損傷可以被逆轉(zhuǎn)[10]。SIRT1是NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；竅11]，其生理功能是除去乙?；?，使DNA鏈能夠緊密纏繞在一起，達(dá)到沉默基因的功能[12]。哺乳動物中，SIRT1是與SIR2同源性最高的同系物，俗稱長壽基因，SIRT1蛋白主要分布在細(xì)胞核中，通過其對組蛋白和非組蛋白的去乙?；饔谜{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和靶蛋白活性，與細(xì)胞衰老密切相關(guān)[13]。周期蛋白依賴性激酶（CDK），是與細(xì)胞周期進(jìn)程相對應(yīng)的一套Ser/Thr激酶系統(tǒng)。各CDK和cyclin結(jié)合形成異二聚體，其中CDK為催化亞基，cyclin為調(diào)節(jié)亞基，不同的cyclin/CDK復(fù)合物通過CDK活性，催化不同底物磷酸化，從而實現(xiàn)對細(xì)胞周期不同時段的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化，其中CDK6與cyclin D1、cyclin D2及cyclin D3結(jié)合，促進(jìn)G1/S轉(zhuǎn)移[14]。

圖3黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的MCR-5細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

miRNA是長度為18~25個核苷酸的非編碼的小分子RNA。它可與靶基因的3’-UTR區(qū)結(jié)合，使靶基因翻譯受到抑制或引起靶基因降解，從而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，在維持機體正常的生理代謝過程中發(fā)揮重要的作用[15]。miR-22是新發(fā)現(xiàn)的一個衰老相關(guān)的miRNA。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，miR-22在人類衰老的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，SIRT1和CDK6是miR-22的靶基因，miR-22可通過抑制SIRT1和CDK6的表達(dá)使pRb去磷酸化，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。

本課題組前期做了大量有關(guān)黃芩苷抗病毒、消炎及抗氧化等功效的實驗研究，當(dāng)發(fā)現(xiàn)黃芩苷對流感病毒致小鼠肺損傷具有良好的保護(hù)作用后，決定在細(xì)胞水平對黃芩苷修復(fù)損傷進(jìn)行研究。

結(jié)果表明，TNF-α誘導(dǎo)MCR-5細(xì)胞損傷率為65.2%，黃芩苷可明顯修復(fù)MCR-5細(xì)胞的損傷，損傷率為52.4%；其可通過下調(diào)損傷細(xì)胞的miR-22表達(dá)、促進(jìn)SIRT1及CDK6的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增強損傷細(xì)胞的生命活力及延長其生命周期?？梢?，黃芩苷具有修復(fù)損傷細(xì)胞的作用，其作用可能與下調(diào)miR-22表達(dá)、增強SIRT1-CDK6路徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。

本研究從細(xì)胞水平對黃芩苷修復(fù)損傷進(jìn)行了初步實驗研究，至于黃芩苷對損傷模型動物的影響如何，有待于進(jìn)一步實驗研究確定。