楊宣濤，徐艷瓊，楊 慧，王晚璞，鄭青青，劉 濤

骨巨細胞瘤(giant cell tumor of bone, GCTB)系一種中間型骨腫瘤，組織學上由腫瘤性單核細胞和均勻分布的破骨細胞樣巨細胞構(gòu)成。但幾乎所有的骨病變均可以有破骨樣巨細胞，如非骨化性纖維瘤、軟骨母細胞瘤、動脈瘤樣骨囊腫等，這常常給準確診斷GCTB帶來很大的干擾，尤其是較小組織的活組織檢查，有時極具挑戰(zhàn)性。近年來，隨著RANKL抑制劑(denosumab)的應用，GCTB的治療取得較好的療效[1]，但同時治療后的GCTB形態(tài)學特征與治療前的差異可以較大，有時完全無破骨樣巨細胞，若在無臨床病史的情況下，診斷尤其困難。

H3.3由1號染色體上的H3F3A基因和17號染色體上的H3F3B基因共同編碼，在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。近年研究發(fā)現(xiàn)GCTB中存在H3F3A基因突變，90%以上為p.G34W突變，并且可以采用免疫組化法檢測H3.3 G34W蛋白表達鑒別診斷GCTB[2-5]，但這類研究多以國外為主，國內(nèi)僅有少量文獻報道，且基因突變與蛋白陽性率多低于國外研究[6-8]。本實驗采用熒光PCR-毛細管電泳測序法和免疫組化法探討H3F3A基因突變和H3.3 G34W突變蛋白在GCTB中的表達及診斷意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集云南省第一人民醫(yī)院2014年1月～2020年8月具有典型的影像學、組織學特點，且標本未經(jīng)脫鈣處理的GCTB 34例(其中原發(fā)性30例，復發(fā)性2例，經(jīng)denosumab治療后2例)，并收集其它富含破骨樣巨細胞的腫瘤40例(其中軟骨母細胞瘤10例，富于巨細胞骨肉瘤3例，甲狀旁腺功能亢進2例，動脈瘤樣骨囊腫10例，非骨化性纖維瘤15例)。所有病例均有完整的病歷資料，樣本來源包括穿刺活檢、病灶刮出和局部手術(shù)切除組織。

1.2 試劑H3.3 G34W一抗購于北京中杉金橋生物公司(兔單克隆抗體，即用型，克隆號RM263)，石蠟包埋組織DNA試劑提取盒購于廈門艾德生物公司。紫外分光光度計SMA4000為AMOY DIAGNOSTICS公司制造，ABI 7500 PCR儀器及ABI 3500Dx基因分析儀為Life Technologies Holdings Pte Ltd公司制造，H3F3A基因第2外顯子突變檢測試劑盒由北京旌準醫(yī)療公司提供(SS-129-24)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、4 μm厚切片，HE染色，鏡下觀察。所有病例均按WHO(2020)骨和軟組織腫瘤分類的診斷標準[9]，由2位副主任病理醫(yī)師診斷。免疫組化染色采用EnVision兩步法。判讀標準：≥10%核中等強度著色為陽性，≥10%核弱～中等強度著色為部分陽性，<10%核弱著色為陰性。

1.3.2熒光PCR-毛細管電泳測序法 蠟塊5 μm厚連續(xù)切片10張，放入滅菌EP管中，組織經(jīng)二甲苯脫蠟后，按照石蠟包埋組織DNA試劑提取盒說明書進行操作，提取樣本DNA，并使用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度。PCR反應體系為25 μL，H3F3A PCR反應液為12.5 μL，引物混合液為10.5 μL，DNA模板為2.0 μL。擴增條件：37 ℃ UDG酶防污染反應10 min 95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，合計40個循環(huán)，然后進行熔解曲線分析，根據(jù)(87.5±1.5) ℃處是否出現(xiàn)熔解峰來判斷是否有目的產(chǎn)物。酶解純化：3 μL的PCR擴增產(chǎn)物和2 μL的酶解混合液混勻后于37 ℃反應60 min，然后80 ℃孵育15 min進行酶變性。測序反應體系配置：酶解后的擴增產(chǎn)物2.0 μL，測序引物3.0 μL，測序試劑1.0 μL，合計6.0 μL測序反應體系。測序反應條件：96 ℃預變性1 min。 96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸2 min，合計30個循環(huán)。測序產(chǎn)物采用醋酸鈉-乙醇沉淀法進行純化后，于ABI 3500Dx基因分析儀進行測序分析。測序結(jié)果與基因組序列進行比對，參考序列為NM_002107.4。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計結(jié)果組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。標志物的診斷指標按下列公式計算：靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征34例GCTB中，男性16例，女性18例，年齡13～71歲，平均34歲，中位年齡31歲。位于長骨30例(占88.6%)，其中股骨15例，脛骨8例，腓骨1例，橈骨5例，肱骨1例；非長骨4例(占11.4%)，其中掌骨、骶骨、胸椎及髕骨各1例。所有病例均有典型的影像學資料，表現(xiàn)為骨端偏心性、膨脹性溶骨性骨質(zhì)破壞，邊界較清，無周邊骨硬化，其中1例突破關(guān)節(jié)囊，累及皮下(圖1)。

圖1 腫瘤位于脛骨上段，體積巨大，突破關(guān)節(jié)囊，累及皮下

2.2 GCTB中H3.3 G34W的表達34例GCTB中32例H3.3 G34W陽性(占94.1%)，均呈強陽性，表現(xiàn)為腫瘤性單核細胞胞核彌漫強著色(圖2)；2例陰性(占5.9%)。其中2例復發(fā)病例亦呈陽性。2例經(jīng)denosumab治療后的組織學形態(tài)表現(xiàn)為顯著的纖維化、巨細胞數(shù)量顯著減少，伴大量的未成熟骨化(圖3)。免疫組化結(jié)果顯示，梭形單核細胞和骨樣基質(zhì)中的瘤細胞H3.3 G34W蛋白均陽性(圖4、5)。

圖2 腫瘤性單核細胞H3.3 G34W呈彌漫強陽性,EnVision兩步法 圖3 deno-sumab治療后顯示纖維化、巨細胞數(shù)量顯著減少,伴大量的未成熟骨化 圖4 deno-sumab治療后梭形單核細胞H3.3 G34W陽性,EnVision兩步法 圖5 denosum-ab治療后骨樣基質(zhì)中的瘤細胞H3.3 G34W陽性,EnVision兩步法 圖6 軟骨母細胞瘤中H3.3 G34W弱陽性,EnVi-sion兩步法

2.3 非GCTB中H3.3 G34W的表達40例富含破骨樣巨細胞的腫瘤中僅1例軟骨母細胞瘤H3.3 G34W部分陽性(2.5%)(圖6)，表現(xiàn)為腫瘤性單核細胞胞核弱陽性；其余病例均為陰性。H3.3 G34W在GCTB的陽性率高于非GCTB(P<0.05，表1)。

表1 骨巨細胞瘤和非骨巨細胞瘤中H3.3 G34W的表達

2.4 H3F3A基因測序結(jié)果34例GCTB均行熒光PCR-毛細管電泳測序檢測，其中1例因蠟塊時間較久(2014年)、DNA質(zhì)量不佳，未能檢出H3F3A突變，其余33例(97.1%)均檢測出H3F3A突變，包括2例復發(fā)病例和2例經(jīng)denosumab治療后的病例。其中31例(91.2%)為p.G34W突變(圖7)，1例(2.9%)為p.G34V突變，1例(2.9%)為p.G34L突變。40例非GCTB均未發(fā)現(xiàn)有H3F3A基因突變。

圖7 熒光PCR-毛細管電泳測序法檢測顯示

2.5 H3.3 G34W蛋白和H3F3A基因突變分析在GCBT診斷中的特異性和敏感性對比分析34例GCTB中，32例H3.3 G34W陽性，H3.3 G34W診斷敏感性為94.1%；33例有H3F3A基因突變，H3F3A基因突變檢測診斷敏感性為97.1%。40例富含破骨樣巨細胞的非GCTB中，僅1例軟骨母細胞瘤H3.3 G34W為部分陽性，特異性為98%；40例非GCTB均未檢測出H3F3A突變，特異性為100%。基因突變檢測在特異性和敏感性上均略高于免疫組化法。兩種方法均與病理診斷具有較好的一致性(P<0.01)。

3 討論

組蛋白H3包括經(jīng)典的H3.2、H3.1及組蛋白變體H3.3。雖然H3.3與H3.2、H3.1在氨基酸序列上僅有個別氨基酸殘基不同，但H3.3在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細胞發(fā)育分化過程中卻顯得更加重要。研究表明，H3.3的編碼基因H3F3A和H3F3B錯義點突變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及骨與軟組織腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]。

GCTB常伴繼發(fā)性改變，包括動脈瘤樣骨囊腫樣改變，廣泛的梗死、纖維母細胞增生、泡沫細胞浸潤，需與其它富含巨細胞的腫瘤鑒別，如非骨化性纖維瘤、軟骨母細胞瘤、動脈瘤樣骨囊腫、甲狀旁腺功能亢進、腱鞘巨細胞瘤瘤等。近年來研究發(fā)現(xiàn)GCTB中存在H3F3A基因p.G34W/L/V/R突變，>90%為p.G34W突變，并且已經(jīng)開發(fā)出特異性抗體可用于GCTB的診斷和鑒別診斷[3-5]。

本組免疫組化結(jié)果顯示，34例GCTB中，32例H3.3 G34W蛋白陽性，陽性率為94.1%，40例非GCTB中僅1例軟骨母細胞瘤呈弱陽性。34例GCTB中33例(97.1%)存在H3F3A突變，其中31例(91.2%)為p.G34W突變，1例為p.G34V突變(2.9%)，1例為p.G34L突變(2.9%)。2例非p.G34W突變者，其相應的H3.3 G34W蛋白表達亦為陰性。本組的H3.3 G34W陽性率及H3F3A突變檢出率與國外文獻報道結(jié)果較一致，高于部分國內(nèi)相關(guān)研究[6-8]，可能是因為本組樣本剔除了經(jīng)脫鈣處理的組織標本。本組1例H3.3 G34W蛋白呈陽性，但未檢測出p.G34W突變，經(jīng)仔細核對，是由于蠟塊年代較久，DNA質(zhì)量不佳所致。Gong等[12]對180例GCTB進行測序發(fā)現(xiàn)，171例(95%)檢出H3F3A突變，其中163例(90.56%)為p.G34W突變，并表達H3.3 G34W蛋白；作者同時發(fā)現(xiàn)2例H3.3 G34W蛋白表達，但p.G34W突變?yōu)橐吧?。Lüke等[13]亦發(fā)現(xiàn)1例H3.3 G34W蛋白表達，但p.G34W突變?yōu)橐吧?。分析兩者不一致的原因可能包含了以下幾種因素：(1)脫鈣導致DNA破壞；(2)蠟塊年份較久或保存不當，導致DNA質(zhì)量不佳；(3)組織標本過少，這也是術(shù)前穿刺活檢中可能遇到的問題；(4)腫瘤的繼發(fā)性改變明顯，如伴出血、梗死、含有較多泡沫狀組織細胞或纖維成分過多等，導致可供檢測的腫瘤細胞數(shù)量過少。但由于基因測序可以檢測出少見的突變類型，故在GCTB診斷中總的敏感性要略高于免疫組化法。

少數(shù)骨肉瘤(包括富于巨細胞的骨肉瘤)與惡性GCTB的鑒別診斷由于H3F3A的檢出而成為一個有爭議的問題。目前，國內(nèi)外對此研究結(jié)果不一。Amary等[3]報道385骨肉瘤中13例存在H3.3 G34突變，13例患者平均年齡34歲(范圍19～64歲)，11例有影像學資料，除1例外均位于關(guān)節(jié)下。故作者認為具有H3.3突變的關(guān)節(jié)下原發(fā)惡性骨腫瘤，即使無良性GCTB的組織學成分，也可能是真正原發(fā)惡性GCTB。該觀點亦得到了Koelsche等[14]的部分認同。Koelsch等發(fā)現(xiàn)約5.7%(6/106)骨肉瘤檢出H3F3A突變，并且這些患者平均年齡超過30歲，中位年齡65歲，僅從H3F3A突變狀態(tài)、年齡和部位特點看，作者推測這6例很可能是惡性GCTB。但這組病例的影像學、組織學和核型上均與普通型骨肉瘤無明顯差異。作者同時進行了甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)具有H3F3A突變的這組病例甲基化譜明顯不同于H3F3A野生型骨肉瘤，而與GCTB更為密切。最終，作者提出具有H3F3A突變的骨肉瘤可能是骨肉瘤中的一種特殊亞型。Yoshida等[15]發(fā)現(xiàn)5例缺乏H3F3A突變的惡性GCTB，F(xiàn)ISH分析表明可能與H3F3A基因的缺失有關(guān)。作者主張將缺乏H3F3A突變的惡性GCTB作為一種特殊亞型。國內(nèi)學者王璇等[6]發(fā)現(xiàn)3例富于巨細胞的骨肉瘤存在H3.3 G34W蛋白表達，而白岳青等[8]報道的3例富于巨細胞的骨肉瘤在蛋白水平及Gong等[12]報道的18例骨肉瘤在基因水平均未檢出H3.3 G34突變。本組3例巨細胞骨肉瘤在蛋白及基因水平檢測結(jié)果均為陰性，復習其放射學及組織學仍歸屬于骨肉瘤。因此，目前骨肉瘤中的H3.3 G34偶然突變成為了一個潛在的診斷難題，究竟是原發(fā)性惡性GCTB，還是屬于骨肉瘤的一個特殊亞型，尚無統(tǒng)一認識。鑒于骨肉瘤中H3.3 G34突變率低，作者建議國內(nèi)學者可以采取多中心合作研究模式來共同探討骨肉瘤尤其是富于巨細胞的骨肉瘤與惡性GCTB間的關(guān)系。

Denosumab是RANKLE抑制劑，通過RANKL/RANKLE通路抑制腫瘤的溶骨性破壞。越來越多的文獻報道，經(jīng)過denosumab治療后，可能會增加刮除術(shù)后患者的局部復發(fā)風險，這可能是由于denosumab治療后引起腫瘤邊緣硬化，導致硬化帶里的腫瘤細胞不能被完全刮出所致[1]。本組2例經(jīng)denosumab治療的病例，組織學顯示大量未成熟骨化組織呈長條索狀、分枝狀排列或相互吻合，似低度惡性中央型骨肉瘤；破骨樣巨細胞顯著減少甚至消失；梭形細胞增生伴顯著纖維化，似非骨化性纖維瘤。2例H3.3 G34W蛋白均呈陽性，表現(xiàn)為腫瘤性單核細胞核彌漫強陽性。同時觀察到位于骨樣基質(zhì)中的瘤細胞也呈核陽性，提示經(jīng)denosumab治療后的腫瘤基質(zhì)細胞仍然存活并且具有成骨功能。這也從組織學角度證實了denosumab治療后的潛在復發(fā)風險。

關(guān)于H3.3 G34W/L/R/V突變的作用機制尚無共識。在一項新近的研究中，Khazaei等[16]分析了細胞模型的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，并在單細胞分辨率下生成了GCTB原發(fā)性腫瘤和原位異種移植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H3.3 G34W通過異常的表觀遺傳重塑，改變了間充質(zhì)祖細胞的分化軌跡，使SPP1+(骨橋蛋白)的成骨樣祖細胞群向ACTA2+(平滑肌肌動蛋白)的肌纖維母細胞群轉(zhuǎn)化，并分泌細胞外基質(zhì)配體，募集并激活破骨細胞，導致GCTB的發(fā)生。并提示這些表觀遺傳變化可能對GCTB的靶向治療起到重要作用。

關(guān)于H3F3A罕見突變類型是否與腫瘤生物學相關(guān)，由于病例少，目前尚無具有統(tǒng)計學意義的相關(guān)報道。Schaefer等[4]對一組病例研究發(fā)現(xiàn)，其中第34例患者3年前空心針穿刺活檢，組織學呈經(jīng)典的GCTB形態(tài)，H3.3 G34W蛋白呈陰性；3年后手術(shù)標本，組織學呈梭形細胞肉瘤形態(tài)，核異型明顯，核分裂易見，免疫組化檢測H3.3 G34W蛋白仍為陰性，基因檢測發(fā)現(xiàn)存在p.G34L突變，診斷為GCTB伴惡性轉(zhuǎn)化。本組發(fā)現(xiàn)1例p.G34L突變，系25歲女性患者，第1次在當?shù)蒯t(yī)院經(jīng)空心針穿刺診斷GCTB后，由于經(jīng)濟原因，放棄治療。4年后就診于我院，腫瘤位于左脛骨近端，體積巨大，大小25 cm×25 cm×20 cm，突破骨質(zhì)，累及肌肉及皮下脂肪組織，臨床考慮惡性。組織學上顯示破骨樣巨細胞數(shù)量減少，但并無明顯的惡變征象，免疫組化檢測H3.3 G34W蛋白為陰性，基因檢測為p.G34L突變。經(jīng)腫瘤切除并關(guān)節(jié)置換術(shù)治療，隨訪近4年，至今未復發(fā)。本例與Schaefer等[4]報道的第34例患者具有一定的相似性：第1次經(jīng)空心針穿刺獲得診斷，3～4年后手術(shù)治療，免疫組化檢測H3.3 G34W蛋白為陰性，基因檢測為p.G34L突變，臨床表現(xiàn)為惡性征象。p.G34L突變是否與更具侵襲性的生物學行為相關(guān)，尚需大樣本的研究。

本組免疫組化檢測H3.3 G34W的敏感性為94.1%，特異性為98%，H3F3A基因突變檢測敏感性為97.1%，特異性為100%。32例H3.3 G34W蛋白陽性者，其中31例(91.2%)檢出p.G34W突變，顯示H3.3 G34W蛋白表達與H3F3A測序間具有很好的相關(guān)性。因此，基于經(jīng)濟成本和時間成本考慮，建議日常診斷工作中，首選H3.3 G34W免疫組化檢測，但對于一些特殊病例，如具有不典型的臨床放射學表現(xiàn)和(或)組織形態(tài)學特征不典型病例，可以加做基因檢測，避免因罕見基因突變類型所致H3.3 G34W蛋白陰性而造成的漏診。另一方面，鑒于H3F3A的高突變率，并且H3.3 G34W突變具有驅(qū)動GCTB發(fā)生的作用，這也為潛在的基因靶向治療提供了依據(jù)。