刁玉佩，李 萍，郭明坤，王 樂(lè)

喉具有發(fā)聲、吞咽、呼吸等關(guān)鍵作用，喉部發(fā)生病變將會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的生理障礙及心理負(fù)擔(dān)。因此，喉癌被稱(chēng)為高度精神創(chuàng)傷性癌癥[1]。其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，雖然目前的治療手段在一定程度上能延長(zhǎng)患者生存期，但存在副作用明顯、預(yù)后效果差、5年生存率低、患者生活質(zhì)量低等問(wèn)題[2]。因此，在提高患者生存率的前提下，尋找安全有效的喉癌治療方法具有重要意義。芒柄花黃素(formononetin, FMN)，別名刺芒柄花素，是一種天然異黃酮，在保肝[3-4]、降糖[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7-8]等方面具有重要作用。FMN對(duì)多種癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，本文應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FMN對(duì)喉癌細(xì)胞的影響，探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為喉癌的臨床治療提供新線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人喉癌TU686細(xì)胞(貼壁生長(zhǎng))購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，采用含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑FMN(上海佳和生物公司)；RPMI 1640、10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco公司)；PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶、0.1%結(jié)晶紫水溶液、4%多聚甲醛(上海阿拉丁生化公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；線(xiàn)粒體膜電位熒光探針JC-1(美國(guó)AAT Bioquest公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試劑盒、RIPA裂解液及實(shí)驗(yàn)中相關(guān)抗體(武漢賽維爾生物公司)。

1.3 主要儀器Navios流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；ECO1.8超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱，T25培養(yǎng)瓶(美國(guó)Thermo Scientific公司)；D3024R低溫高速離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器公司)；EPS300電泳儀、VE180微型垂直電泳、VE186轉(zhuǎn)移垂直電泳槽(上海天能科技公司)。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 提前將完全培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素)置于37 ℃水浴中預(yù)熱；當(dāng)取出冷凍保存的人喉癌TU686細(xì)胞株后，經(jīng)37 ℃水浴快速融化，轉(zhuǎn)移至已加入完全培養(yǎng)基的離心管中，1 000 r/min離心5 min后棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸，吹打混勻后移至T25培養(yǎng)瓶，置于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底超過(guò)80%，可用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸后，將細(xì)胞稀釋至每毫升5×104個(gè)，每孔100 μL接種于96孔板，即控制每孔5 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃ 5%CO2)。每孔加入10 μL不同濃度的FMN(濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L)培養(yǎng)24 h后，加入10 μL CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)指示計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力，篩選合適劑量。

1.4.3克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸后，將細(xì)胞稀釋至每毫升5×104個(gè)，按每孔100 μL接種于6孔板，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃ 5%CO2)，棄培養(yǎng)液，分別加入濃度為0、10、20、40 μmol/L的FMN，7天后棄溶液，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，棄固定液，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染色液，室溫晾干。用Epson Perfection V200掃描儀拍照，用軟件計(jì)數(shù)，并計(jì)算克隆細(xì)胞形成率。

1.4.4Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸后，將細(xì)胞稀釋至每毫升5×104個(gè)，按每孔100 μL接種于96孔板，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃ 5%CO2)，棄培養(yǎng)液，分別加入濃度為0、10、20、40 μmol/L的FMN，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，藥物作用48 h，用預(yù)冷的PBS洗滌，加入裂解液處理30 min，收集細(xì)胞，離心15 min(4 ℃、12 000 r/min)，收集上清液。按照BCA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量。取樣后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗、二抗處理后，加入顯色劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，消化、稀釋、分組等操作同1.4.4，藥物作用48 h，收集細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入Annexin V-FTTC溶液重懸細(xì)胞，避光孵育10 min，離心棄上清液，PI冰盒中避光孵育10 min，洗去染色液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，消化、稀釋、分組等操作同1.4.4，藥物作用48 h，收集細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄上清，根據(jù)線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，加入JC-1熒光探針染液，置于培養(yǎng)箱20 min(37 ℃ 5%CO2)，洗去染色液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.7試劑盒檢測(cè)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激標(biāo)志物 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，消化、稀釋、分組等操作同1.4.4，藥物作用48 h，收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于PBS中，反復(fù)凍融3次破壞細(xì)胞膜，分別按照SOD及MDA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4.8Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌TU686細(xì)胞，消化、稀釋、分組等操作同1.4.4，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)p53、Caspase-9、Caspase-3相應(yīng)抗體的表達(dá)，具體操作同上。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞活力的影響本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同濃度FMN(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L)，結(jié)果顯示與FMN 0 μmol/L組相比，F(xiàn)MN 10 μmol/L組對(duì)TU686細(xì)胞活力的抑制作用較小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨藥物濃度的增加，自20 μmol/L開(kāi)始，F(xiàn)MN對(duì)TU686細(xì)胞活力的抑制作用增加，差異有顯著性(P<0.05，圖1)。

圖1 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞活力的影響

2.2 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞生長(zhǎng)的影響本實(shí)驗(yàn)根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，設(shè)置不同濃度FMN(0、10、20、40 μmol/L)，結(jié)果顯示與FMN 0 μmol/L組相比，F(xiàn)MN 10 μmol/L組細(xì)胞克隆形成率與之相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞克隆形成率降低，F(xiàn)MN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用增加，差異有顯著性(P<0.05)；隨藥物濃度的增加，濃度為40 μmol/L時(shí)，克隆細(xì)胞形成率不足20%，F(xiàn)MN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最佳(圖2)。上述結(jié)果提示，F(xiàn)MN能夠降低喉癌TU686細(xì)胞的克隆形成率，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。

圖2 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：

2.3 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)MN濃度為0 μmol/L及10 μmol/L時(shí)，Ki-67、PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)水平相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濃度為20 μmol/L時(shí)，Ki-67、PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，F(xiàn)MN對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增加，差異有顯著性(P<0.05)；隨著藥物濃度的增加，濃度為40 μmol/L時(shí)FMN對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(圖3)。上述結(jié)果提示，F(xiàn)MN能夠降低喉癌TU686細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用。

圖3 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞增殖的影響：

2.4 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)MN濃度為0 μmol/L及10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率水平相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與0 μmol/L組相比，濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率上升，F(xiàn)MN對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用增加，差異有顯著性(P<0.05)；隨藥物濃度的增加，濃度為40 μmol/L時(shí)FMN對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用最強(qiáng)(圖4)。上述結(jié)果提示，F(xiàn)MN能夠提高喉癌TU686細(xì)胞的凋亡率，對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。

圖4 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞凋亡的影響：

2.5 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響活性線(xiàn)粒體損傷是細(xì)胞凋亡早期階段的顯著特征，其中包括膜電位的改變。與FMN 0 μmol/L組相比，隨藥物濃度逐漸增加，綠色熒光細(xì)胞百分比增加，表明線(xiàn)粒體膜電位下降，其中20、40 μmol/L組促進(jìn)線(xiàn)粒體膜的去極化(圖5)。上述結(jié)果提示FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，可能是通過(guò)降低膜電位，促進(jìn)線(xiàn)粒體膜去極化。

圖5 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響：

2.6 FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響與FMN 0 μmol/L組相比，隨藥物濃度逐漸增加，除FMN 10 μmol/L組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余兩組(FMN 20、40 μmol/L)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶SOD活性顯著下降(P<0.05)，過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA的含量顯著上升(P<0.05，圖6)，說(shuō)明體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡，發(fā)生氧化應(yīng)激作用，細(xì)胞線(xiàn)粒體受到損傷。上述結(jié)果提示，F(xiàn)MN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，可能是通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)線(xiàn)粒體損傷。

圖6 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞線(xiàn)粒體

2.7 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與FMN 0 μmol/L組相比，隨著藥物濃度逐漸增加，除FMN 10 μmol/L組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余兩組(FMN 20、40 μmol/L)的p53、Cleaved cas9/cas9及Cleaved cas3/cas3表達(dá)均顯著上升(P<0.05，圖7)。提示FMN誘導(dǎo)喉癌TU686細(xì)胞凋亡可能與p53依賴(lài)性線(xiàn)粒體凋亡途徑有關(guān)。

圖7 不同濃度FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞p53信號(hào)通路

3 結(jié)論

喉癌的發(fā)病率位居頭頸部惡性腫瘤的第2位[9]，其發(fā)病早期的主要臨床表現(xiàn)為聲音嘶啞及嗓內(nèi)異物感，而晚期的主要特征是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10]。喉、下咽、氣管及咽旁間隙解剖學(xué)上相連，功能上相輔，一旦發(fā)生腫瘤則可彼此相損，嚴(yán)重威脅患者生命[11]。FMN藥理作用廣泛，其中抗腫瘤作用顯著。Zhang等[12]的研究指出FMN可通過(guò)改變ERK磷酸化水平及調(diào)控Caspase-3和BAX/BCL-2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡；Wu等[7]研究發(fā)現(xiàn)FMN通過(guò)調(diào)控miR-21和PTEN抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲；劉紅兵等[13]研究表明FMN可通過(guò)下調(diào)p-AKT和BCL-2表達(dá)、上調(diào)BAX表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。FMN能抑制多種癌細(xì)胞，表明其具有治療腫瘤的潛力。

本組應(yīng)用不同濃度的FMN處理喉癌TU686細(xì)胞，一段時(shí)間后細(xì)胞活力、細(xì)胞形成率及Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)均顯著降低，提示FMN對(duì)喉癌TU686細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有一定的抑制作用。該結(jié)果與Kim等[14]報(bào)道的FMN可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的結(jié)果相吻合。本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)喉癌TU686細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示隨著FMN濃度增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升，提示FMN能夠提高喉癌TU686細(xì)胞的凋亡率，對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化及氧化應(yīng)激水平，其中線(xiàn)粒體膜電位的變化是能量代謝變化的標(biāo)志，是凋亡發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[15]，而SOD與MDA是重要的抗氧化-氧化平衡指標(biāo)，間接測(cè)定膜系統(tǒng)的損傷程度[16]。本組結(jié)果提示，F(xiàn)MN能誘導(dǎo)喉癌TU686細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與降低膜電位，促進(jìn)線(xiàn)粒體膜去極化，刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)線(xiàn)粒體損傷有關(guān)。該結(jié)果與李寧等[17]研究細(xì)胞凋亡與線(xiàn)粒體相關(guān)性的結(jié)論一致。

轉(zhuǎn)錄因子p53可調(diào)節(jié)一系列靶分子，參與細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、增殖、應(yīng)激反應(yīng)等生物過(guò)程[18]。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡刺激信號(hào)時(shí)，誘發(fā)BAX等促凋亡蛋白活化，線(xiàn)粒體兩側(cè)膜電位下降，促進(jìn)凋亡小體的生成，并通過(guò)自我剪切方式活化Caspase-9，Caspase-9進(jìn)一步對(duì)下游Caspase-3進(jìn)行活化，Cleaved cas3進(jìn)一步破壞細(xì)胞骨架及管家基因的功能，影響正常細(xì)胞信號(hào)傳遞及周期調(diào)節(jié)，從而使細(xì)胞出現(xiàn)核凝結(jié)、核裂解等凋亡形態(tài)學(xué)上的改變[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p53、Cleaved cas9/cas9及Cleaved cas3/cas3均顯著上升。因此，F(xiàn)MN可能通過(guò)以下幾種凋亡途徑誘導(dǎo)TU686細(xì)胞凋亡：p53高表達(dá)導(dǎo)致BCL-2/BAX表達(dá)失調(diào)誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體途徑凋亡(p53依賴(lài)性)；線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)(MPT)導(dǎo)致的線(xiàn)粒體途徑凋亡(非p53依賴(lài)性)；p53高表達(dá)通過(guò)死亡受體/配體途徑導(dǎo)致的非線(xiàn)粒體途徑凋亡。

綜上所述，F(xiàn)MN在喉癌中發(fā)揮抗腫瘤作用，能夠抑制喉癌TU686細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因FMN作用后p53、Cleaved cas9/cas9及Cleaved cas3/cas3的表達(dá)上調(diào)，猜測(cè)其機(jī)制很可能與p53依賴(lài)性線(xiàn)粒體凋亡途徑相關(guān)。本組后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步對(duì)該途徑中BCL-2/BAX及APAF1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)以明確凋亡機(jī)制。