門 慧，談 順

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。探討胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制從而尋求有效的治療手段是現(xiàn)階段研究的重要任務(wù)[1-2]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的土壤，腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移需要新生血管支持，而血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成的基礎(chǔ)[3]。EGFL6屬于EGF重復(fù)超級家族，是一種分泌蛋白，特征是EGF結(jié)構(gòu)域重復(fù)，由于同時具有EGF結(jié)構(gòu)域和MAM結(jié)構(gòu)域，又被命名為MAEG，參與細(xì)胞周期、增殖及發(fā)育調(diào)節(jié)[4]。文獻(xiàn)報道，EGFL6在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤血管形成：如EGFL6促進(jìn)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成[5]；EGFL6能促進(jìn)卵巢癌[6]、結(jié)直腸癌[7-9]侵襲、轉(zhuǎn)移；EGFL6在黑色素瘤[10-11]、鼻咽癌[12]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[13]、肺腺癌[14]中高表達(dá)；EGFL6促進(jìn)斑馬魚胚胎血管形成[15]。迄今為止，EGFL6在胃癌微環(huán)境中的生物學(xué)作用尚未見報道。本文著重探討EGFL6在胃癌血管生成中的作用，為臨床腫瘤治療提供新的分子治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器細(xì)胞株、胃癌組織均來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自BI生物公司，0.25%胰酶購自Life公司，EGFL6多克隆抗體購自Abcam公司，CD34抗體購自福州邁新公司，過表達(dá)質(zhì)粒購自廣州銳博公司，慢病毒上清自提，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒購自Bioword公司，5×SDS蛋白上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光液、全蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司，電泳儀購自BAYGENE公司，低溫高速離心機(jī)購自Thermo公司，蛋白濃度的酶標(biāo)儀購自BIO-BRAD公司，分光光度計及低溫離心機(jī)購自Thermo公司。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑購自TaKaRa公司，β-actin單克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株及人類血管內(nèi)皮細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇狀態(tài)佳的細(xì)胞株用于實驗。

1.2.2EGFL6過表達(dá)穩(wěn)定株構(gòu)建 提前48 h鋪工具細(xì)胞293T于75 cm2培養(yǎng)瓶中，至細(xì)胞融合度達(dá)70%左右，細(xì)胞液換成無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，取2.5 μg EGFL6質(zhì)粒、5 μL HIV包裝質(zhì)?；旌弦河?.5 mL無菌EP管，加入Opti-Mem液至200 μL；加入15 μL EndoFection轉(zhuǎn)染試劑于1.5 mL無菌EP管，加入Opti-Mem至200 μL，將本次200 μL混合液加入前一支1.5 mL EP管，混勻，靜置20 min。然后再把混合液加入293T細(xì)胞中，再加入1/500總體積的Titerboost增強(qiáng)劑。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，用含5%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基換液(內(nèi)含有雙抗1 ∶100比例配置)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取病毒上清，離心、過濾，-80 ℃保存。前一天鋪MGC803細(xì)胞于6孔板中，至細(xì)胞融合度約70%，用已收集好的病毒上清換液，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，用含5%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基換液(內(nèi)含有雙抗1 ∶100比例配置)，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿，用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基藥篩，最后擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3RT-PCR (1)細(xì)胞及組織總RNA提?。杭?xì)胞生長鋪滿瓶底，PBS洗3次，每10 cm2瓶壁面積加入1 mL Trizol試劑，于冰上裂解5 min，0.2 mL氯仿/1 mL Trizol比例加入氯仿，混勻冰上置2～3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上層水相轉(zhuǎn)移至去酶1.5 mL離心管，沉淀RNA中加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，除上清，收沉淀，DEPC處理過的水配制75%乙醇洗滌，離心，室溫放置自然干燥，DEPC水溶解RNA，測RNA濃度。組織總RNA提取：研缽洗凈置180 ℃烤箱烘烤5 h，冷卻備用，研缽中加入適量的液氮，將組織剪約綠豆大小研磨成粉末狀，加入Trizol 1 mL勻漿裂解，裂解物移至DEPC水處理過的1.5 mL微離心管中，余步驟同前。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑配制反應(yīng)體系，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DEPC水稀釋約4倍，-20 ℃保存，備用。(3)RT-PCR反應(yīng)：EGFL6引物序列：上游5′-AG GCATCACGGGTTGTTAGC-3′；下游5′-CGTAGCAG CAGGCCAGTTTAG-3′，根據(jù)TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃約30 s、72 ℃ 34 s，合計40個循環(huán)。7500 Fast Real-time PCR儀取得各模板Ct值，以Folds=2-ΔΔCt代表實驗組及對照組目的基因表達(dá)關(guān)系。

1.2.4Western blot法 (1)蛋白濃度測定-BCA法：采用Bioworld公司BCA Protein Assay Reagengt Kit進(jìn)行檢測。酶標(biāo)儀器測量570 nm處吸光度值(OD值)，測量蛋白濃度。(2)Western blot：配制10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠，每個泳道上樣量40 μg，進(jìn)行電泳。根據(jù)蛋白Marker位置切目的條帶，Bio-Rad微型電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，200 mA電流，冰上轉(zhuǎn)膜，條帶封閉(含約5%脫脂奶粉或血清的PBST)1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜，加入HRP標(biāo)記抗兔二抗，室溫孵育約1 h，PBST洗膜。于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行發(fā)光。

1.2.5條件培養(yǎng)基的制備 胃癌細(xì)胞株置于75 cm2的培養(yǎng)瓶，長滿至瓶底面積80%～90%，PBS洗2次，改用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液至無菌離心管，離心、棄沉淀，取上清，置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6雞胚尿囊膜實驗 取6～7日齡的雞胚，在超凈臺內(nèi)用有齒小鑷鈍頭在氣室中心敲開一個直徑約1 cm小洞，將直徑約0.8 cm無菌的橡膠圈放入已暴露好的雞胚尿囊膜表面，條件培養(yǎng)基約200 μL加入橡膠圈中，醫(yī)用膠白布封口，置于37 ℃、80%濕度的孵箱內(nèi)孵育48～72 h。取出處理好的雞胚，將丙酮與甲醇混合液(1 ∶1比例配置)滴入尿囊膜表面，固定15 min，尿囊膜輕輕剪下來，生理鹽水浸泡，撈片、攤片，拍照。

1.2.7小管形成實驗 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC饑餓過夜，將Matrigel基質(zhì)膠鋪于24孔板，每孔200 μL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min，每孔鋪2×104個HUVEC細(xì)胞于基質(zhì)膠上并加入200 μL條件培養(yǎng)基，于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h，鏡下觀察小管形成情況。

1.2.8Transwell遷移實驗 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC饑餓過夜，將600～800 μL條件培養(yǎng)基加入24孔板下室中，上室加約200 μL細(xì)胞懸液，每個小室加入2×105個細(xì)胞，置37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約12 h。取出小室，用PBS液沖洗小室3次，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，蘇木精染色。顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)，取上、下、左、右、中5個視野，計數(shù)穿過膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.9免疫組化 采用免疫組化SP法染色。具體步驟：烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清工作液封閉、一抗4 ℃冰箱孵育過夜、生物素標(biāo)記二抗、辣根過氧化物酶孵育、DAB顯色、蘇木精染色、脫水、透明、干燥、封固定。判斷標(biāo)準(zhǔn)[16]：(1)按細(xì)胞著色強(qiáng)度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細(xì)胞所占百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項得分結(jié)果相加：3～4分為低表達(dá)，5～7分為高表達(dá)。微血管密度(microvessel density, MVD)計數(shù)[16-18]：取3個腫瘤血管密度最高的熱點區(qū)(100×)，在這3個熱點區(qū)隨機(jī)計數(shù)5個視野微血管數(shù)目(200×)，取5個視野微血管數(shù)目均值為本例的MVD(微血管是指管腔直徑約>8個紅細(xì)胞直徑的總和)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組均數(shù)間比較采用配對樣本t檢驗，生存率的比較采用Mantel-Cox檢驗，取α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中EGFL6 mRNA的表達(dá)RT-PCR技術(shù)檢測40例配對新鮮胃癌組織中EGFL6 mRNA表達(dá)，與周圍正常胃黏膜組織比較，胃癌組織中EGFL6 mRNA高表達(dá)31例，低表達(dá)9例。結(jié)果顯示與周圍正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中EGFL6 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05，圖1)。

圖1 RT-PCR技術(shù)檢測40例新鮮配對胃癌組織中EGFL6 mRNA的表達(dá)水平：

2.2 EGFL6表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性利用Kaplan-Meier生存曲線分析EGFL6表達(dá)與胃癌患者5年生存時間的關(guān)系，31例高表達(dá)組患者的中位生存時間為36個月，9例低表達(dá)組患者的中位生存時間為48個月。EGFL6高表達(dá)患者5年生存率明顯低于EGFL6低表達(dá)患者(P<0.05，圖2)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析EGFL6表達(dá)與胃癌患者5年生存率的關(guān)系

2.3 胃癌組織中EGFL6的表達(dá)與腫瘤MVD計數(shù)的關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示，在胃癌組織中EGFL6高表達(dá)39例，低表達(dá)11例，高表達(dá)組MVD計數(shù)平均為(36.46±0.71)個/HPF，低表達(dá)組MVD計數(shù)平均為(16.64±0.92)個/HPF(圖3A～D)；EGFL6高表達(dá)組的MVD計數(shù)明顯高于低表達(dá)組(P<0.05，圖3E)。

圖3 A.EGFL6在胃癌組織中高表達(dá)；B.EGFL6高表達(dá)胃癌組織中的MVD;C.EGFL6在胃癌組織中低表達(dá);D.EGFL6低表達(dá)胃癌組織中的MVD;E.EGFL6高表達(dá)組與低表達(dá)組MVD計數(shù)統(tǒng)計圖

2.4 Western blot法及RT-PCR技術(shù)檢測胃癌細(xì)胞株中EGFL6內(nèi)源性表達(dá)Western blot法及RT-PCR檢測3株胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803中EGFL6的表達(dá)水平，結(jié)果顯示EGFL6在MGC803細(xì)胞中表達(dá)水平最低(圖4)。

圖4 A.Western blot法檢測3株胃癌細(xì)胞株中EGFL6蛋白表達(dá)；B.RT-PCR技術(shù)檢測3株胃癌細(xì)胞株中EGFL6 mRNA表達(dá)

2.5 Western blot法及RT-PCR技術(shù)檢測慢病毒感染效率Western blot法及RT-PCR技術(shù)檢測EGFL6慢病毒過表達(dá)載體感染MGC803細(xì)胞后EGFL6水平，結(jié)果顯示：MGC803/MOCK組及MGC803/EGFL6組帶有綠色熒光的病毒載體成功轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株中(圖5A)；與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組EGFL6的蛋白及mRNA水平均明顯上調(diào)(圖5B、C)，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 A.熒光顯微鏡檢測目的病毒載體成功轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株中;B.Western blot法檢測MGC803/EGFL6穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建效率;C.RT-PCR技術(shù)檢測MGC803/EGFL6穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建效率

2.6 Western blot法檢測條件培養(yǎng)基中EGFL6蛋白表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果顯示，與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖6)。

圖6 Western blot法檢測條件培養(yǎng)基中EGFL6蛋白表達(dá)

2.7 血管形成實驗雞胚尿囊膜實驗、小管形成實驗及內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗觀察EGFL6促進(jìn)體內(nèi)、外血管形成情況，與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組體內(nèi)、外血管形成能力明顯增加(圖7)，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；提示EGFL6能夠促進(jìn)體內(nèi)、外血管形成能力。

圖7 A.雞胚尿囊膜實驗觀察體內(nèi)血管形成能力;B.小管形成實驗觀察體外血管形成能力;C.內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗觀察體外血管形成能力;D.內(nèi)皮細(xì)胞穿過小室膜數(shù)量統(tǒng)計圖

3 討論

胃癌是全球發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一。由于其復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率均較高，患者預(yù)后較差。腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移是一個多因素、多階段復(fù)雜的病理過程，需要多種基因相互調(diào)控協(xié)助工作，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移需要新生血管的形成，為其提供各種細(xì)胞因子及營養(yǎng)成分。生理情況下，機(jī)體僅在需要時才會有新生血管形成，而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展時這種平衡狀態(tài)

會被打破，最終使得腫瘤內(nèi)血管不斷形成。目前胃癌的治療在手術(shù)、放化療等方面取得了較大進(jìn)展，但生存率結(jié)果依然不容樂觀，而抗腫瘤血管生成治療在胃癌治療中起重要作用[19-23]。

EGFL6蛋白是EGF重復(fù)超級家族中的一員，其特征是EGF結(jié)構(gòu)域重復(fù)，由于同時具有EGF結(jié)構(gòu)域和MAM結(jié)構(gòu)域，又被命名為MAEG，參與細(xì)胞周期、增殖及發(fā)育調(diào)節(jié)，由于包括了1個N端信號肽，所以是一種分泌蛋白。EGFL6與乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等腫瘤均密切相關(guān)，EGFL6促進(jìn)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成，EGFL6通過p-ERK促進(jìn)骨微環(huán)境血管生成從而促進(jìn)骨質(zhì)愈合[24]，EGFL6促進(jìn)斑馬魚胚胎血管形成，同家族成員EGFL7可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤及腎細(xì)胞癌血管形成[25-27]，EGFL6在胃癌微環(huán)境中的作用至今尚未見文獻(xiàn)報道。

本實驗通過RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的EGFL6 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，EGFL6表達(dá)與胃癌患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)。采用免疫組化法檢測胃癌組織中EGFL6蛋白表達(dá)，并利用CD34計數(shù)MVD，結(jié)果顯示高表達(dá)EGFL6組MVD計數(shù)明顯增多，說明EGFL6有促進(jìn)胃癌組織血管形成的趨勢。為了驗證這一現(xiàn)象，本實驗采用血管形成實驗進(jìn)一步分析，選取內(nèi)源性表達(dá)較低的胃癌細(xì)胞株MGC803進(jìn)行EGFL6慢病毒過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建，RT-PCR及Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。收集過表達(dá)MGC803/EGFL6胃癌細(xì)胞株條件培養(yǎng)基，Western blot法檢測結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)基制備成功。利用血管形成實驗(雞胚尿囊膜實驗、小管形成實驗及內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗)檢測胃癌組織中血管生成情況，結(jié)果顯示EGFL6促進(jìn)胃癌血管形成。

本實驗結(jié)果表明，EFGL6在胃癌中高表達(dá)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并能促進(jìn)胃癌血管形成，但EGFL6在胃癌組織中促進(jìn)血管形成具體作用機(jī)制及信號通路仍不清楚，有待后續(xù)實驗深入探究。EGFL6有望成為腫瘤標(biāo)志物的篩查指標(biāo)，為臨床腫瘤診治及新藥研究提供新的靶點依據(jù)，更好的服務(wù)于患者。