安曉靜，柏苗苗，謝振年，伍志強，趙 坡

結(jié)直腸癌的侵襲和復(fù)發(fā)是影響預(yù)后的主要因素。目前，對于結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍缺乏長期有效的治療方法。尋找抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的靶點對于緩解疾病意義重大。頭小畸形相關(guān)基因(abnormal spindle-like microcephaly associated, ASPM)是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，在多種實體腫瘤中發(fā)揮促癌基因作用[1-2]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)ASPM在結(jié)腸癌組織中表達升高，與結(jié)腸癌組織中β-catenin的表達呈正相關(guān)[3]。但尚未在體外實驗中探討ASPM對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)性能的影響。本文通過體外實驗觀察ASPM對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及對β-catenin的調(diào)節(jié)，為結(jié)腸癌靶向治療和改善預(yù)后積累研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人源結(jié)腸癌細(xì)胞株SW116、HCT116、HT29、DLD1、SW620和LS180均來自中國人民解放軍總醫(yī)學(xué)院第一醫(yī)學(xué)中心生物治療科。

1.1.2試劑 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。CCK8試劑盒購自碧云天生物公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自三箭生物公司；ASPM抗體購自Lifespan公司，β-catenin抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞復(fù)蘇后使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，選擇處于生長對數(shù)期的細(xì)胞作為研究對象。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：選取生長狀態(tài)較好的結(jié)腸癌細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。首次轉(zhuǎn)染帶有熒光標(biāo)記的陰性對照組，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染率達80%以上即可。計數(shù)細(xì)胞密度后接種于6孔板中，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行操作，siRNA-NC轉(zhuǎn)染組為陰性對照(negative control, NC)組。將siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48 h后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中ASPM的表達，選取兩種沉默效果較好的siRNA序列作為后續(xù)實驗，設(shè)為siRNA1組和siRNA2組。同時設(shè)置空白組(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)。LiCl是Wnt信號通路的激活劑，因此挽救實驗中設(shè)置NC組、siRNA組和siRNA+LiCl組。

1.2.2CCK8法檢測細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，接種于96孔板中，重復(fù)3孔，每孔加入培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的SW116和HCT116細(xì)胞，以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合達80%時，加入siRNA，每組設(shè)立3個復(fù)孔，每孔加入10 μL CCK8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每孔的光密度(optical density, OD)值。

1.2.3Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 將小室板上室包被、水化基質(zhì)膠，于小室板下室中加入550 μL 10%無血清細(xì)胞懸液(每毫升細(xì)胞5×104個)及siRNA-ASPM，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室板進行固定染色，中性樹膠封固，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張載玻片隨機拍攝5個視野，計數(shù)并取均值作為1次實驗結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞平鋪于6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后，吸出培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心管中，洗滌細(xì)胞。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明，通過流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5Western blot法 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總蛋白。按照每孔50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，添加ASPM和β-catenin一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗稀釋液，室溫孵育1～2 h，加ECL發(fā)光液，在暗盒中使用X光膠片曝光，拍照。Quantity One軟件進行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白actin的灰度值比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.6qRT-PCR 利用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計分析RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后，采用qRT-PCR擴增目的基因，以actin為內(nèi)參分析ASPM和β-catenin的表達，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)。相對表達量以2-△△Ct表示。

2 結(jié)果

2.1 不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中ASPM蛋白表達檢測6種不同結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT29、SW116、HCT116、DLD1、SW620和LS180)中ASPM蛋白表達，結(jié)果顯示SW116和HCT116細(xì)胞株中ASPM蛋白表達高于其他細(xì)胞株(圖1)。

圖1 不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中ASPM蛋白表達：

2.2 siRNA-ASPM后轉(zhuǎn)染后，不同處理組中HCT116和SW116細(xì)胞內(nèi)ASPM的表達選取兩種ASPM蛋白表達較高的HCT116和SW116結(jié)腸癌細(xì)胞作為實驗對象。HCT116和SW116細(xì)胞均設(shè)NC組、siRNA-ASPM-2559組、siRNA-ASPM-9315組、siRNA-ASPM-10413組和siRNA-ASPM-10049組。siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染48 h后，HCT116細(xì)胞中，siRNA-ASPM-2559、siRNA-ASPM-9315、siRNA-ASPM-10413和siRNA-ASPM-10049組中ASPM mRNA相對表達量分別為0.24±0.02、0.12±0.01、0.77±0.02、0.61±0.05(圖2)，干擾效果分別為24.4%、11.9%、77.4%和61.1%。SW116細(xì)胞中，siRNA-ASPM-2559、siRNA-ASPM-9315、siRNA-ASPM-10413和siRNA-ASPM-10049組中ASPM mRNA相對表達量分別為0.47±0.03、0.22±0.02、0.39±0.04、0.69±0.03(圖3)，干擾效果分別為46.9%、22.0%、39.4%和69.1%。結(jié)果顯示，加入siRNA后，RT-PCR檢測顯示ASPM mRNA相對表達量空白組(HCT116和SW116均為1±0)與NC組(HCT116為1.16±0.01，SW116為1.10±0.02)中ASPM的表達差異無顯著性。故后續(xù)實驗未再設(shè)置空白組。

圖2 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，不同處理組中HCT116細(xì)胞內(nèi)ASPM的表達變化

圖3 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，不同處理組中SW116細(xì)胞內(nèi)ASPM的表達變化

2.3 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后SW116和HCT16細(xì)胞的增殖siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，siRNA組HCT116細(xì)胞和SW116細(xì)胞與NC組相比，細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05，圖4、5)。

圖4 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，不同處理組中HCT116細(xì)胞的存活率

圖5 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，不同處理組中的SW116細(xì)胞的存活率

2.4 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后SW116和HCT116細(xì)胞的侵襲能力變化siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，HCT116細(xì)胞中，siRNA-ASPM-2559組和siRNA-ASPM-9315組的Transwell小室下層細(xì)胞計數(shù)較NC組明顯減少(P<0.05，表1，圖6)。

圖6 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，不同處理組HCT116細(xì)胞的侵襲能力：

在SW116細(xì)胞中，siRNA-ASPM-9315組侵襲進入小室下層的細(xì)胞數(shù)較NC組明顯減少(P<0.05)；siRNA-ASPM-10413組進入小室下層的細(xì)胞數(shù)較NC組減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1，圖7)。

表1 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后HCT116和SW116細(xì)胞的侵襲能力

2.5 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后HCT116和SW116細(xì)胞的凋亡siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，HCT116細(xì)胞中siRNA-ASPM-2559組和siRNA-ASPM-9315組細(xì)胞凋亡率與NC組相比，均明顯升高(P<0.05，圖8)。SW116細(xì)胞中，siRNA-ASPM-9315組和siRNA-ASPM-10413組細(xì)胞凋亡率分別與NC組相比，凋亡率明顯上升，差異有顯著性(P<0.05，圖9)。

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默ASPM表達后HCT116細(xì)胞凋亡率：

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默ASPM表達后SW116細(xì)胞凋亡率：

2.6 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，HCT116細(xì)胞中ASPM和β-catenin的表達siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，siRNA組HCT116細(xì)胞中ASPM和β-catenin水平與NC組相比，顯著降低(P<0.05，圖10)。

圖10 轉(zhuǎn)染siRNA-ASPM后，HCT116細(xì)胞中ASPM和β-catenin mRNA和蛋白的表達：

2.7 Wnt信號通路激活劑LiCl對β-catenin表達的影響qRT-PCR和Western bolt實驗結(jié)果證實，與siRNA-ASPM-2559組相比，siRNA-ASPM-2559+LiCl組能夠增加β-catenin mRNA的升高(P<0.05)；β-catenin蛋白表達水平亦有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖11)。

圖11 挽救實驗檢測加入LiCl后對β-catenin的表達的影響：

2.8 siRNA-ASPM轉(zhuǎn)染后，HCT116細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達為進一步觀察ASPM對β-catenin表達的影響，實驗選擇了沉默效果較好的siRNA-ASPM-2559探針進行轉(zhuǎn)染，進行核質(zhì)分離實驗。轉(zhuǎn)染后，siRNA組HCT116細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中β-catenin水平與NC組相比，均明顯降低(P<0.05，圖12)。

圖12 轉(zhuǎn)染siRNA-ASPM后，HCT116細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達：

3 討論

ASPM是果蠅有絲分裂紡錘體蛋白的人類同源基因[4]。ASPM編碼的蛋白是一種紡錘體極/中間體蛋白，其作用在于調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的方向和胞質(zhì)的分離[5]。在胰腺癌細(xì)胞中，將ASPM基因敲除，胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯下降[2]。在前列腺癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，敲除ASPM后，前列腺癌細(xì)胞的增殖速度減慢，減少了處于S期的癌細(xì)胞的比例；同時，前列腺癌細(xì)胞的成球能力和侵襲能力亦下降明顯[6]。

本組實驗檢測了6株結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT29、SW116、HCT116、DLD1、SW620和LS180)中ASPM的蛋白表達，結(jié)果顯示6株結(jié)腸癌細(xì)胞中ASPM蛋白表達不同，其中SW116和HCT116細(xì)胞中ASPM的蛋白表達最高。選擇ASPM蛋白含量較高的結(jié)腸癌細(xì)胞，進行siRNA轉(zhuǎn)染，48 h后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力均明顯降低，但凋亡率升高，提示沉默ASPM基因可引發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)能力降低。

Wnt/β-catenin信號通路是胚胎發(fā)育過程中最重要的分子調(diào)節(jié)機制，同時在成熟組織中也調(diào)節(jié)了細(xì)胞的再生和平衡發(fā)展。多數(shù)結(jié)直腸癌中，均存在著由于細(xì)胞內(nèi)的某些成分突變導(dǎo)致Wnt信號通路過度激活的現(xiàn)象。大部分結(jié)腸癌發(fā)生的核心步驟是Wnt信號通路中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無法降解，入核內(nèi)聚集引發(fā)下游效應(yīng)因子[7]。在胰腺癌PANC-1和AsPC-1細(xì)胞株中檢測發(fā)現(xiàn)，沉默ASPM后導(dǎo)致β-catenin蛋白水平持續(xù)降低[2]。但在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)ASPM是通過直接調(diào)節(jié)DVL3蛋白的穩(wěn)定性間接影響了β-catenin的穩(wěn)定性，免疫共沉淀實驗證實ASPM與DVL3具有相關(guān)性，而與β-catenin并無直接的相關(guān)性[6]。

本實驗結(jié)果顯示，干擾結(jié)腸癌細(xì)胞中ASPM的表達，細(xì)胞中β-catenin mRNA和蛋白的表達均降低。進一步行核質(zhì)分離實驗后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達均顯著下降。挽救實驗中加入Wnt信號通路激活劑LiCl后，β-catenin mRNA的表達有所回升。蛋白表達雖有所回升，但差異無顯著性。由此推測ASPM可能通過調(diào)節(jié)β-catenin激活Wnt信號通路發(fā)揮作用，且對β-catenin在胞質(zhì)中的聚集即開始發(fā)揮影響。但ASPM是直接影響了β-catenin的表達，還是作用于其上游調(diào)節(jié)因子間接影響了β-catenin的表達有待于進一步證實。在挽救實驗中，β-catenin mRNA水平有所恢復(fù)，但差異無顯著性，推測可能存在其他分子機制影響了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，是后續(xù)研究值得探索的現(xiàn)象。

綜上所述，ASPM維持了結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。將ASPM沉默后結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖活性降低，細(xì)胞侵襲力下降，凋亡率升高，可能與ASPM引起β-catenin的異常表達有關(guān)，本實驗初步分析了ASPM對結(jié)腸癌表觀指標(biāo)的影響，具體機制有待深入探討。