李育剛，許晴晴，魏珊珊

成纖維細胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α, FAP-α)是一種新發(fā)現(xiàn)的促腫瘤生長因子，在腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移、內(nèi)皮細胞增殖以及新生血管生成等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[1]?，F(xiàn)階段FAP-α已被證實在肺癌、食管癌以及胃癌等腫瘤中高表達，與患者預(yù)后密切相關(guān)，而FAP-α在結(jié)直腸癌中的研究較少[2-4]。本實驗采用免疫組化ELPS法檢測FAP-α蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性及患者預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取TCGA數(shù)據(jù)庫來源的結(jié)直腸癌組織中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM格式的數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)作為在線數(shù)據(jù)庫研究對象，包含698例結(jié)直腸癌標(biāo)本。選取2015年4月～2017年4月我院存檔的118例結(jié)直腸癌術(shù)后病理切片和臨床資料。所有患者通過電話或門診隨訪3年，隨訪截至2020年4月30日。其中男性68例，女性50例，年齡42～68歲，平均(54.42±5.12)歲。同時選取上述病例中30例結(jié)直腸癌患者的癌旁組織，納入28例混合痔患者術(shù)后正常黏膜組織和31例內(nèi)鏡下行結(jié)直腸息肉切除術(shù)后的結(jié)直腸腺瘤組織，作為對照組。本實驗通過鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院倫理委員會審核給予免除簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)合臨床特點及術(shù)后病理明確診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌。(2)既往未曾罹患腫瘤或自身免疫性疾病。(3)術(shù)后生存時間≥3個月，有完整的臨床隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型腫瘤；(2)未行結(jié)直腸癌根治術(shù)；(3)術(shù)前曾接受過放、化療或中醫(yī)治療；(4)腫瘤以外其他原因?qū)е碌幕颊咚劳觥?/p>

1.2 方法

1.2.1樣品采集及保存 結(jié)直腸癌、癌旁、正常黏膜和腺瘤組織標(biāo)本，均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，用于免疫組化染色。

1.2.2生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析 通過基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)網(wǎng)站(http: //gepia2.cancer-pku.cn)分析FAP-α在結(jié)直腸癌中的表達水平[5]。以FAP-α中位水平為界分為FAP-α低表達和FAP-α高表達，使用survminer和survival R語言包進行生存資料的預(yù)后分析[6]。

1.2.3免疫組化 采用免疫組化ELPS法檢測結(jié)直腸癌、癌旁、正常黏膜、腺瘤組織中FAP-α的表達。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行，將5 μm厚的組織切片脫蠟水化，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，在檸檬酸(pH 6.0，0.01 mol/L，95 ℃)中加熱15 min，然后緩慢冷卻修復(fù)抗原。封閉液37 ℃孵育30 min，加入anti-FAP-α抗體4 ℃過夜。次日加二抗37 ℃孵育20 min，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺法顯色，蘇木精復(fù)染后，脫水封固定，熒光倒置生物顯微鏡下觀察陽性染色程度。由至少兩位病理醫(yī)師對陽性細胞染色強度和陽性細胞百分比進行獨立評估：(1)根據(jù)陽性細胞染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽性染色細胞百分比評分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：0～4分為低表達，5～10分為高表達。

1.2.4主要試劑與儀器 甲醛、HE染液，購自上海谷研公司。二氨基聯(lián)苯胺、3%過氧化氫，購自上海研生公司。anti-FAP-α抗體購自上海戶實公司，生物組織包埋機購自濟南歐萊博公司，熒光倒置生物顯微鏡購自賽默飛世爾公司。

1.2.5觀察指標(biāo) 比較正常黏膜組織、癌旁組織、腺瘤組織和結(jié)直腸癌組織中FAP-α的表達；FAP-α表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性；分析FAP-α表達與患者預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌組織中FAP-α的表達TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常組織相比，F(xiàn)AP-α在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。預(yù)后生存曲線分析顯示，F(xiàn)AP-α低表達組的預(yù)后顯著優(yōu)于FAP-α高表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌組織中FAP-α的表達(A)及預(yù)后分析(B)

2.2 不同結(jié)直腸組織中FAP-α的表達免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中FAP-α高表達組75例，F(xiàn)AP-α低表達組43例。結(jié)直腸癌組織中FAP-α的免疫組化得分顯著高于正常黏膜組織、癌旁組織、腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。癌旁組織中的FAP-α的免疫組化得分亦顯著高于正常黏膜組織和腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.01，t=6.64，P<0.05，表1，圖2)。

表1 結(jié)直腸癌組織、正常黏膜組織、癌旁組織及腺瘤組織中FAP-α的表達[n(%)]

ABCDE圖2 不同結(jié)直腸組織中FAP-α的表達:A.正常黏膜組織中FAP-α不表達;B.癌旁組織中少數(shù)細胞弱表達FAP-α;C.腺瘤間質(zhì)中少數(shù)細胞中等強度表達FAP-α;D.結(jié)直腸癌組織中FAP-α低表達;E.結(jié)直腸癌組織中FAP-α高表達,ELPS法

2.3 結(jié)直腸癌組織中FAP-α蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AP-α表達與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯有關(guān)，高表達組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯的比例均顯著高于低表達組(χ2=21.912，χ2=5.591，P均<0.05)，其表達與患者年齡、性別、BMI、ECOG評分、原發(fā)灶部位、浸潤深度、腫瘤直徑、分化程度、神經(jīng)侵犯、病理分型、RAS突變、手術(shù)時間均無關(guān)(P均>0.05，表2)。

表2 結(jié)直腸癌組織中FAP-α表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 結(jié)直腸癌中FAP-α表達與患者預(yù)后的關(guān)系術(shù)后隨訪3年，F(xiàn)AP-α高表達組患者的病死率為37.33%，F(xiàn)AP-α低表達組患者的病死率為18.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033)。結(jié)直腸癌患者的平均總生存期(overall survival, OS)為(30.12±5.26)個月，平均無進展生存期(progression-free survival, PFS)為(28.32±5.51)個月。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AP-α高表達組的OS顯著低于FAP-α低表達組(t=5.232，P<0.001，圖3)。此外，F(xiàn)AP-α高表達組患者的PFS亦顯著低于FAP-α低表達組(t=5.317，P<0.001，圖4)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析FAP-α表達與結(jié)直腸癌患者總生存期的關(guān)系

圖4 Kaplan-Meier生存曲線分析FAP-α表達與結(jié)直腸癌患者無進展生存期的關(guān)系

3 討論

腫瘤相關(guān)纖維母細胞(tumor associated fibroblasts, CAF)是腫瘤微環(huán)境中最常見的腫瘤基質(zhì)細胞之一。通過分泌細胞因子、生長因子、趨化因子和細胞外基質(zhì)降解酶，促進炎癥途徑，破壞免疫監(jiān)視，重建細胞外基質(zhì)，形成腫瘤生態(tài)，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。FAP-α是CAF的重要表面標(biāo)志物，屬于脯氨酸特異性絲氨酸蛋白酶家族[1]。其在90%以上惡性上皮性腫瘤中高表達，但在多數(shù)正常組織中并不表現(xiàn)出FAP-α活性[2-4]。由于FAP-α特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，被廣泛用作腫瘤檢測和預(yù)后評估的重要標(biāo)志物[7]。本實驗擬結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫檢測FAP-α在結(jié)直腸癌組織中的表達，并通過臨床標(biāo)本進行驗證，探究FAP-α與臨床病理特征的相關(guān)性及預(yù)后價值。

本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AP-α表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與既往研究相似，多項研究均證實FAP-α可能是腫瘤發(fā)生血管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子，如食管鱗狀細胞癌、腎細胞癌、胃癌等[3,8]。最近研究結(jié)果表明，F(xiàn)AP-α同時具有外肽酶和內(nèi)肽酶活性，可以在細胞表面發(fā)揮蛋白水解酶活性，通過降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤生長、浸潤轉(zhuǎn)移、淋巴管及血管生成，并且與FAP-α高表達細胞共培養(yǎng)，還可促進其他細胞類型(包括腫瘤、內(nèi)皮細胞和免疫細胞)的增殖、活化和侵襲[9]。目前，F(xiàn)AP-α促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制尚未明確。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移主要取決于淋巴管的生成，通過腫瘤細胞浸潤到腫瘤內(nèi)的淋巴管，然后到達附近的淋巴結(jié)。因此，淋巴管密度可能是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌癥進展的敏感指標(biāo)。Cheng等[10]的實驗結(jié)果證明，食管鱗癌中的CAF密度與腫瘤淋巴管密度的增加顯著相關(guān)。此外，血管生成也是腫瘤轉(zhuǎn)移的必不可少病理過程，微血管密度作為血管生成的定量指標(biāo)被認為是評估血管生成活性的重要指標(biāo)。Chen等[11]的實驗結(jié)果證實肺鱗狀上皮癌中FAP-α的表達與微血管密度和淋巴管密度之間均呈正相關(guān)。Cao等[12]的實驗結(jié)果亦證實FAP-α可以通過Akt和ERK信號通路促進結(jié)直腸癌的血管生成。作為對血管生成中起重要作用的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，已經(jīng)被證實與腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。由于FAP-α可以釋放VEGF刺激血管網(wǎng)絡(luò)的形成，因此FAP-α可能通過相同的機制誘導(dǎo)腫瘤的血管生成和淋巴管生成。

本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AP-α表達與患者年齡、性別、BMI、ECOG評分、原發(fā)灶部位、浸潤深度、腫瘤直徑、分化程度、神經(jīng)侵犯、病理分型、RAS基因突變、手術(shù)時間均無關(guān)；與術(shù)后生存期呈負相關(guān)。這與TCGA數(shù)據(jù)庫所獲取的預(yù)后分析結(jié)果相同，既往研究亦顯示多種腫瘤類型中FAP-α的表達具有預(yù)后價值，并且FAP-α本身可促進各種細胞類型的促腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等功能[1]。Chen等[14]的研究結(jié)果顯示，在人結(jié)直腸癌樣本中，F(xiàn)AP-α高表達的CAF通過上調(diào)CCL2分泌、招募髓系細胞、降低T細胞活性，促進結(jié)直腸癌腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制，F(xiàn)AP-α高表達預(yù)示結(jié)直腸癌患者較低的生存期。此外，在其他腫瘤中亦證實，如胃癌中FAP-α高表達的病例亦顯示豐富的基因途徑，用于免疫調(diào)節(jié)、血管生成、細胞遷移以及細胞分化和生長，與胃癌分級、淋巴結(jié)和腹膜浸潤及OS差相關(guān)[15-16]。FAP-α在腫瘤組織中的過表達與不良OS和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系更緊密，尤其在結(jié)直腸癌或胰腺癌中更為顯著。FAP-α通過調(diào)節(jié)T細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞抑制腫瘤免疫，進而在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[17]，并且在適當(dāng)?shù)谋尘昂蜋z測方法下FAP-α可以作為各種人類腫瘤類型中有價值的預(yù)后標(biāo)志物。

綜上，本實驗結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中FAP-α表達上調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯有關(guān)，對于結(jié)直腸癌預(yù)后有一定的參考價值。