許 莉，陳 娜

武漢市第一醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢 430022

淋病是一種由革蘭氏陰性淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）感染引起的性傳播疾病。50%以上的女性Ng感染是無(wú)癥狀的，成為淋病防控的巨大隱患，患者因延誤就醫(yī)可引起上行性感染，誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎和盆腔炎［1］。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)女性無(wú)癥狀Ng感染與患者體內(nèi)孕激素水平增高有關(guān)［2］，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)孕激素可促進(jìn)小鼠陰道局部Ng感染［3］，但孕激素是通過何種機(jī)制抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答并引起無(wú)癥狀Ng 感染有待深入研究。NLRP3 炎性體是一類大分子蛋白質(zhì)，它能活化半胱天冬酶?1（Caspase?1），并引起白細(xì)胞介素（interleukin，IL）?1β、IL?18等促炎細(xì)胞因子的分泌，參與機(jī)體抵抗病原體免疫應(yīng)答［4-5］。NLRP3 炎性體介導(dǎo)的IL?1β表達(dá)導(dǎo)致Th17/Treg 失衡，誘導(dǎo)T 細(xì)胞向Th17 分化［6］。Th17 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL?17在機(jī)體抵抗Ng感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，Ng 可誘導(dǎo)陰道黏膜局部產(chǎn)生Treg，其與Ng 慢性無(wú)癥狀感染有關(guān)［8］。我們推測(cè)孕激素通過影響NLRP3 炎性體的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致Th17/Treg失衡，從而在淋病無(wú)癥狀感染中發(fā)揮作用。本研究建立小鼠脾細(xì)胞Ng 感染模型，觀察孕激素對(duì)Ng 刺激后NLRP3 炎性體表達(dá)及Th17/Treg 分化的影響，為孕激素在無(wú)癥狀Ng 感染中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），淋巴細(xì)胞分離液（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司），孕酮（Sigma 公司，美國(guó)），TRIzol（Invitrogen 公司，美國(guó)），anti?NL?RP3 抗體（Abcam 公司，美國(guó)），anti?Caspase?1p20 抗體、anti?RORγt 單抗、anti?Foxp3 單抗（Santa 公司，美國(guó)），CD4?FITC、CD25?APC、IL?17?PE、Foxp3?PE抗體（Ebioscience 公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO公司，日本），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa公司，日本），IL?17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（fransforming growth facfor，TGF）?β、IL?10 ELISA 試劑盒（Abcam公司，美國(guó)）。

Ng ATCC 49226 標(biāo)準(zhǔn)株由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。菌株經(jīng)Ng 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并制備成D（600 nm）值為0.15的細(xì)菌懸液。

1.2 方法

1.2.1 脾細(xì)胞體外培養(yǎng)及處理

雌性BALB/c 小鼠，6～8 周齡，體重18～20 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2%戊巴比妥麻醉小鼠，無(wú)菌取脾臟，勻漿分離脾細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離液分離出脾淋巴細(xì)胞，RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整濃度至2×106個(gè)/mL。在24 孔板中每孔加入1 mL 脾淋巴細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)基，細(xì)胞分為5 組：①空白對(duì)照組（用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)3 d）；②Ng組（加入2×107CFU/mL Ng 懸液作用3 d）；③Ng+1×10-9mol/L 孕酮組（預(yù)先加入1×10-9mol/L 孕酮作用細(xì)胞2 h，再加入2×107CFU/mL Ng懸液作用3 d）；④Ng+1×10-8mol/L 孕酮組（預(yù)先加入1×10-8mol/L 孕酮作用細(xì)胞2 h，再加入2×107CFU/mL Ng 懸液作用3 d）；⑤Ng+1×10-7mol/L 孕酮組（預(yù)先加入1×10-7mol/L 孕酮作用細(xì)胞2 h，再加入2×107CFU/mL Ng懸液作用3 d）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例

將每組脾淋巴細(xì)胞懸液分為4管，1管用于檢測(cè)Th17細(xì)胞，1管用于檢測(cè)Treg細(xì)胞，另2管分別為相應(yīng)同型對(duì)照。分別加入CD4?FITC、CD25?APC、IL?17?PE、Foxp3?PE抗體進(jìn)行染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3 和Th17/Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3mRNA的表達(dá)

用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，取1 μg用于逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑說明操作。所用引物序列如下：NLRP3 上游：5′?AAGCAGCAGATG?GAGACTGGAAA?3′，下游：5′?TGAACAGAGCCCTG?GC AGGTAG?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為149 bp；RORγt 上游：5′?TTTGGAACTGGCTTTCCATC?3′，下游：5′?AA?GATCTGCAGCTTTTCCACA?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為123 bp；Foxp3 上游：5′?CCCAGGAAAGACAGCAACCTT?3′，下游：5′?TTCTCACAACCAGGCCACTTG?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為89 bp；內(nèi)參β?actin：上游5′?TTCCTTCTTGGG?TATGGAAT ? 3′，下 游：5′ ? GAGCAATGATCTT?GATCTTC?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為203 bp。

1.2.4 Western blot 檢 測(cè)NLRP3、Caspase?1p20、RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)水平

提取培養(yǎng)細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定樣品蛋白濃度。取各組不同組分蛋白樣品60 μg，經(jīng)10%SDS?PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移膜，加入稀釋后的一抗37 ℃孵育1 h，洗膜后加入稀釋的特異性二抗及SP?HRP 37 ℃孵育2 h，洗膜后用0.05%DAB緩沖液避光顯色。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL?1β 和Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL?17、TGF?β、IL?10的含量

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)完成后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組樣品的IL?1β、IL?17、TGF?β、IL?10含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），各組間的比較采用LSD 法。應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脾臟Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的變化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，各組間Th17 和Treg細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=124.32、148.58，P均＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，Ng 感染組脾臟Th17 細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例升高。加入孕酮預(yù)處理后，脾臟Th17 細(xì)胞比例隨著孕酮作用濃度的增高而降低，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例隨著孕酮作用濃度的增高而增高，加入1×10-8mol/L 或1×10-7mol/L 孕酮能明顯下調(diào)脾臟Th17 細(xì)胞比例，上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例（圖1）。

圖1 脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例（n=5）Figure 1 The proportions of Th17 cells and Treg cells in murine splenocytes（n=5）

2.2 細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Th17/Treg 特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3 mRNA表達(dá)的變化

RT?PCR 結(jié)果顯示，各組間NLRP3、RORγt、Forp3 mRNA比較、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=126.48、253.18、119.82，P均＜0.01）。Ng 刺激小鼠脾細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、RORγt、Foxp3 mRNA 表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加，分別為空白對(duì)照組的5.48 倍（t=9.46，P＜0.01）、6.18 倍（t=11.82，P＜0.01）和2.74 倍（t=7.47，P＜0.01）。加入孕酮預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、RORγt mRNA 表達(dá)水平隨著孕酮濃度的增高而降低，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達(dá)水平隨著孕酮濃度的增高而增高。加入1×10-8mol/L或1×10-7mol/L孕酮能明顯降低Ng 刺激引起的脾細(xì)胞內(nèi)NLRP3、RORγt mRNA 表達(dá)水平，上調(diào)Foxp3 mRNA 表達(dá)水平，與Ng組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.61、9.78、13.29，P均＜0.01，圖2）。

圖2 細(xì)胞內(nèi)NLRP3、RORγt、Foxp3 mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果Figure 2 Real?time PCR results of NLRP3，RORγt and Foxp3 in murine splenocytes

2.3 細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase?1p20、RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)的變化

Western blot 結(jié)果顯示，NLRP3、Caspase?1p20、RORγt、Foxp3 蛋白各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=129.85、123.57、131.62、115.74，P均＜0.01）。Ng刺激小鼠脾細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase?1p20、RORγt、Foxp3 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加，分別為空白對(duì)照組的5.62 倍（t=10.58，P＜0.01）、5.71倍（t=11.56，P＜0.01）、5.69 倍（t=12.04，P＜0.01）和2.82倍（t=8.39，P＜0.01）。加入孕酮預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、caspase?1p20、RORγt蛋白表達(dá)水平隨著孕酮濃度的增高而降低，F(xiàn)oxp3 蛋白表達(dá)水平隨著孕酮濃度的增高而增高。加入1×10-8mol/L或1×10-7mol/L 孕酮能明顯降低Ng 刺激引起的脾細(xì)胞內(nèi)NL?RP3、Caspase?1p20、RORγt 蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Foxp3 蛋白表達(dá)水平，與Ng 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.48、12.83、10.39、14.36，P均＜0.01，圖3）。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)NLRP3、caspase?1p20、RORγt、Foxp3 蛋白表達(dá)情況Figure 3 Expression of NLRP3，caspase?1p20，RORγt and Foxp3 proteins in murine splenocytes of each group

2.4 培養(yǎng)上清中IL?1β和Th17/Treg 相關(guān)細(xì)胞因子IL?17、TGF?β、IL?10含量的變化

ELISA結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL?1β、IL?17、TGF?β、IL?10 水平各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=193.65、219.82、152.56、189.71，P均＜0.01）。Ng 刺激小鼠脾細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL?1β、IL?17、TGF?β、IL?10含量明顯增加，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.81、15.87、12.15、13.49，P均＜0.01）。加入孕酮預(yù)處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL?1β、IL?17水平隨著孕酮濃度的增高而降低，TGF?β、IL?10 水平隨著孕酮濃度的增高而增高。加入1×10-8mol/L或1×10-7mol/L孕酮能有效抑制Ng刺激引起的脾細(xì)胞IL?1β、IL?17 的分泌，促進(jìn)TGF?β、IL?10的分泌，與Ng 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.94、10.28、13.57、12.83，P均＜0.01，表1）。

表1 培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL?1β、IL?17、TGF?β、IL?10含量的變化Table 1 The levels of IL?1β，IL?17，TGF?β and IL?10 in the cellular supernatant（pg/mL，）

表1 培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL?1β、IL?17、TGF?β、IL?10含量的變化Table 1 The levels of IL?1β，IL?17，TGF?β and IL?10 in the cellular supernatant（pg/mL，）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與Ng組比較，#P＜0.01。

3 討論

NLRP3炎性體是由NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase?1組成的一種分子量約為700 kDa的大分子蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮外源性微生物或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)感受器的作用，它能使無(wú)活性的Caspase?1前體轉(zhuǎn)化為活性Caspase?1，后者可裂解IL?1β、IL?18、IL?33前體以形成活性形式并分泌［4］。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎性體介導(dǎo)的IL?1β的表達(dá)導(dǎo)致Th17/Treg 失衡，誘導(dǎo)T 細(xì)胞向Th17 分化，引起局部炎癥反應(yīng)和組織損傷［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，Ng刺激小鼠脾細(xì)胞后，Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞比例升高，NLRP3、Th17/Treg 特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞上清中Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL?17、TGF?β、IL?10 水平亦增加。這一結(jié)果表明在Ng 感染小鼠脾細(xì)胞的體外模型中Ng 可誘導(dǎo)NLRP3 炎性體表達(dá)，促進(jìn)Th17、Treg 分化和免疫反應(yīng)。Th17 和Treg 分別在促進(jìn)免疫應(yīng)答和抑制免疫方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ng在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中能選擇性地誘導(dǎo)Th17 免疫反應(yīng)。Th17 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL?17可觸發(fā)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)，包括誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化、產(chǎn)生抗菌蛋白［7］。感染Ng后陰道黏膜局部產(chǎn)生的Treg 與慢性無(wú)癥狀淋球菌感染有關(guān)［8］。

孕激素與性傳播疾病關(guān)系非常密切，孕激素可下調(diào)宮頸細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶?2的表達(dá)并抑制膠原的組織，而且月經(jīng)周期的激素變化能影響微生物的黏附［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)女性Ng下生殖道感染發(fā)展為上行性感染的敏感性可隨著月經(jīng)周期變化［11-12］。另外前期研究也發(fā)現(xiàn)，孕激素通過促進(jìn)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素和TGF?β的產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制及減輕炎癥反應(yīng)的作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，孕酮可促進(jìn)T細(xì)胞向Treg分化，但抑制其向Th17細(xì)胞分化［14-16］。這些都說明孕激素具有免疫調(diào)節(jié)功能，能影響機(jī)體對(duì)Ng的易感性及炎癥反應(yīng)。本研究預(yù)先加入不同濃度的孕酮作用后，Ng刺激的Th17 細(xì)胞比例、NLRP3 和Th17 特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA 和蛋白表達(dá)、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子IL?17 的分泌隨著孕酮濃度的增加而逐漸降低，Treg細(xì)胞比例、Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA和蛋白表達(dá)、Treg相關(guān)細(xì)胞因子TGF?β、IL?10的分泌隨著孕酮濃度的增加而逐漸增加。這表明孕酮可抑制Ng感染誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞中NLRP3 表達(dá)及Th17 分化，促進(jìn)Ng感染誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞分化。

本研究發(fā)現(xiàn)孕激素通過抑制Ng感染誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞中NLRP3 表達(dá)及Th17 分化、促進(jìn)Treg 細(xì)胞分化而發(fā)揮免疫抑制作用。與我們前期在動(dòng)物體內(nèi)的研究結(jié)果一致，這為解釋孕激素在女性無(wú)癥狀Ng感染中的作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，可為女性無(wú)癥狀Ng感染的防治提供新思路，同時(shí)也為研制新的抗Ng藥物提供新靶點(diǎn)。