魯 佩，宋日進(jìn)，張 煒，鄭 明，桂澤平，王子杰，王增軍，顧 民

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210029

草酸鈣結(jié)石是泌尿系結(jié)石中最常見的類型，約占80%以上［1］。草酸鈣結(jié)石的形成過程中，高草酸尿及草酸鈣結(jié)晶會(huì)使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，從而促使草酸鈣結(jié)晶附著于腎小管上皮細(xì)胞表面，導(dǎo)致結(jié)晶滯留，誘發(fā)草酸鈣結(jié)石的形成。我們既往研究也同樣表明，在草酸鈣結(jié)晶導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞損傷中發(fā)生了顯著的氧化應(yīng)激過程，且可能參與了腎小管上皮細(xì)胞的損傷以及后續(xù)的結(jié)石形成［2］。然而，目前臨床上尚缺乏對草酸鈣結(jié)晶導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞損傷的有效治療措施，因此，進(jìn)一步探究草酸鈣結(jié)石形成的機(jī)制及其臨床干預(yù)措施具有十分重要的實(shí)用價(jià)值。

優(yōu)克龍是一種新型植物提取劑，主要成分為柳櫟浸膏提取物，提取物中含有大量的鞣酸物質(zhì)，近年來被國內(nèi)外臨床研究證實(shí)可促進(jìn)泌尿系結(jié)石的排出［3］。在大鼠腎結(jié)石模型中，研究人員觀察到優(yōu)克龍干預(yù)后，大鼠尿液中的尿鈣水平以及氧化應(yīng)激水平顯著降低，且腎結(jié)石的形成受到抑制，提示優(yōu)克龍具有抗氧化應(yīng)激的作用［4］。然而優(yōu)克龍對泌尿系結(jié)石形成的影響及機(jī)制仍不明確，且缺乏相應(yīng)的研究。鑒于此，本研究通過大鼠草酸鈣結(jié)石模型和草酸鈣細(xì)胞模型，探究優(yōu)克龍對草酸鈣結(jié)石形成的調(diào)控作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型構(gòu)建

本研究用大鼠均為SPF級(jí)雄性SD大鼠，月齡3個(gè)月，體重150～200 g，購自北京維通利華公司。所有大鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并于適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)將上述大鼠分為對照組、模型組和優(yōu)克龍干預(yù)組，每組10只。其中，對照組自由飲用滅菌水。模型組和干預(yù)組采用2%氯化銨2 mL/d灌胃14 d、10%葡萄糖酸鈣1.5 mL 腹腔注射14 d，并給予持續(xù)1%乙二醇自由飲水滿28 d。此外，干預(yù)組采用灌胃方式連續(xù)給予優(yōu)克龍100 mg/kg，維持28 d。優(yōu)克龍均采用1 mL 橄欖油溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用，對照組和模型組均給予1 mL橄欖油灌胃處理。

1.1.2 細(xì)胞、分組及干預(yù)

人腎小管上皮細(xì)胞系（HK?2）（武漢益普生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，并隨機(jī)分為對照組、模型組和柳櫟浸膏提取物干預(yù)組。其中，對照組培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，無任何干預(yù)；模型組給予一水草酸鈣結(jié)晶（146 μg/cm2），并聯(lián)合培養(yǎng)24 h；α?硫辛酸（α?lipoic acid，α?LA）干預(yù)組同時(shí)給予一水草酸鈣結(jié)晶（146 μg/cm2）和α?LA（1×10-4mol/L），并聯(lián)合培養(yǎng)24 h；優(yōu)克龍干預(yù)組同時(shí)給予一水草酸鈣結(jié)晶（146 μg/cm2）和柳櫟浸膏提取物（30 μg/mL），并聯(lián)合培養(yǎng)24 h。

1.1.3 主要試劑

動(dòng)物用優(yōu)克龍及細(xì)胞用柳櫟浸膏提取物（本院提供）；乙二醇溶液、氯化銨溶液（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司），葡萄糖酸鈣溶液（四川省維克奇生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用丙二醛（malonaldehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxidative dismutase，SOD）ELISA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Beclin 1、活化Caspase 3、p38 MAPK 及磷酸化p38 MAPK抗體（Abcam公司，英國）；α?LA（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 尿液樣本收集及檢測

分別將建模第28 天的3 組大鼠置于代謝籠中收集24 h 尿液，加入甲苯防腐。尿鈣、尿鎂均采用全自動(dòng)生化分析儀（Beckman公司，美國）檢測，通過離子色譜儀（Metrohm 公司，瑞士）檢測各組大鼠尿液中草酸及枸櫞酸鹽的水平。

1.2.2 標(biāo)本收集及HE染色

分別收集3組大鼠在建模第28天的腎臟，并分別置于石蠟固定及液氮保存。腎組織經(jīng)石蠟固定、HE 染色后，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照，比較3組大鼠腎組織中草酸鈣結(jié)晶的數(shù)量。

1.2.3 免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測蛋白水平

分別提取3 組大鼠腎組織的總蛋白和3 組細(xì)胞的總蛋白，檢測上述蛋白中自噬、凋亡以及相關(guān)通路的磷酸化水平。采用BCA 法檢測組織或細(xì)胞的蛋白濃度，并行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別給予相應(yīng)一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，加入ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光。曝光條帶采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 細(xì)胞上清氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

分別提取3組細(xì)胞的上清，并采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）和相關(guān)試劑盒，依照試劑盒的操作方法檢測3 組細(xì)胞上清中MDA及SOD水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究的所有資料均采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析處理。定量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的方式表示，兩組之間的比較均采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)克龍對大鼠腎臟草酸鈣晶體形成的影響

對3組大鼠腎組織進(jìn)行了HE染色（圖1A）。與對照組相比，模型組的腎小管呈現(xiàn)大部分腎小管擴(kuò)張、刷狀緣消失等典型的急性損傷表現(xiàn)，且在腎小管中可見彌漫性草酸鈣結(jié)晶形成；而優(yōu)克龍干預(yù)組的腎臟組織中，腎小管急性損傷減輕，腎小管中草酸鈣晶體的數(shù)量也顯著減少（P=0.007，圖1B），提示優(yōu)克龍可顯著降低大鼠腎臟草酸鈣結(jié)晶的形成，并減少腎小管上皮細(xì)胞的損傷。

圖1 優(yōu)克龍對大鼠腎臟草酸鈣晶體形成的影響Figure 1 Effect of urocalum on calcium oxalate crystal formation in rat kidney

2.2 優(yōu)克龍對大鼠尿液生化指標(biāo)的影響

收集了3 組大鼠的24 h 尿液，并對尿液中的成石危險(xiǎn)成分進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，模型組的尿鈣水平顯著高于對照組，而優(yōu)克龍干預(yù)后尿鈣水平顯著下降（P＜0.05，圖2A）；相反，模型組的尿鎂水平顯著低于對照組（P＜0.05，圖2B），優(yōu)克龍干預(yù)后尿鎂水平顯著上升（P=0.007，圖2B）。24 h 尿液檢測結(jié)果顯示，模型組尿枸櫞酸排泄量顯著低于干預(yù)組（P=0.046，圖2C）和對照組（P=0.003，圖2C）；而模型組尿草酸排泄量顯著高于干預(yù)組和對照組（P＜0.001，圖2D）。以上結(jié)果提示，優(yōu)克龍可通過降低大鼠尿草酸的排泄量抑制草酸鈣晶體的形成。

2.3 優(yōu)克龍對大鼠尿液中氧化應(yīng)激水平及腎組織中自噬凋亡水平的影響

為探討優(yōu)克龍抑制大鼠腎臟草酸鈣晶體形成的機(jī)制，我們檢測了大鼠尿液中MDA 的水平，發(fā)現(xiàn)大鼠模型組24 h尿液中MDA水平最高，并顯著高于對照組（P＜0.05）和干預(yù)組（P=0.006，圖2E）。此外還比較了3 組大鼠腎組織中自噬凋亡水平的差異。結(jié)果提示，模型組中存在顯著的自噬及凋亡激活過程，而優(yōu)克龍可明顯抑制自噬及凋亡的激活（圖2F）。

圖2 優(yōu)克龍對大鼠尿液生化指標(biāo)、氧化應(yīng)激及自噬水平的影響Figure 2 Effects of urocalum on urinary biochemical indexes，oxidative stress and autophagy in rats

2.4 草酸鈣結(jié)晶對腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激、自噬和凋亡水平的影響

為探究草酸鈣結(jié)晶形成中對腎臟氧化應(yīng)激、自噬和凋亡水平的影響，使用氧化應(yīng)激抑制劑——α?LA 抑制草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程。3 組細(xì)胞上清檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組MDA水平顯著升高，而α?LA明顯抑制了草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的MDA升高（P＜0.001，圖3A）；模型組SOD水平顯著低于干預(yù)組（P=0.036）和對照組（P=0.039，圖3B）。此外，草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)了細(xì)胞中Beclin 1和活化的Caspase 3 水平的升高，而α?LA 可抑制上述過程（圖3C）。上述結(jié)果表明，草酸鈣結(jié)晶可通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激過程，進(jìn)而促進(jìn)自噬的激活和細(xì)胞凋亡。

圖3 草酸鈣結(jié)晶對腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激、自噬和凋亡的影響Figure 3 Effects of calcium oxalate crystallization on levels of oxidative stress，autophagy and apoptosis in renal tubular epi?thelial cells

2.5 優(yōu)克龍對草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、自噬和凋亡水平的影響

為進(jìn)一步探究優(yōu)克龍對草酸鈣結(jié)晶形成的影響及機(jī)制，我們使用優(yōu)克龍干預(yù)草酸鈣結(jié)晶及腎小管上皮細(xì)胞。與α?LA類似，優(yōu)克龍可顯著減緩草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的MDA 水平升高（P＜0.001，圖4A）和SOD 的下降（P=0.029，圖4B）；與模型組相比，優(yōu)克龍干預(yù)后細(xì)胞中的Beclin 1和活化的Caspase 3水平顯著降低（圖4C）。此外，草酸鈣結(jié)晶可誘導(dǎo)細(xì)胞中p38 MAPK 的磷酸化水平升高，而優(yōu)克龍可顯著抑制p38 MAPK 的磷酸化水平（圖4D）。提示優(yōu)克龍可能抑制草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程，降低MAPK通路激活，減少腎小管上皮細(xì)胞中自噬的激活和細(xì)胞凋亡的進(jìn)展。

圖4 優(yōu)克龍對草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、自噬和凋亡的影響Figure 4 Effects of urocalum on oxidative stress，autophagy and apoptosis induced by calcium oxalate crystallization

3 討論

本研究通過優(yōu)克龍干預(yù)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)克龍可顯著抑制大鼠腎臟草酸鈣結(jié)石的形成。在此過程中，腎臟的氧化應(yīng)激過程、細(xì)胞自噬和凋亡過程均被明顯抑制，提示優(yōu)克龍抑制腎臟草酸鈣結(jié)石的形成與上述機(jī)制有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了草酸鈣結(jié)晶的細(xì)胞模型，并在該模型中采用優(yōu)克龍進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)克龍可顯著抑制由草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程，進(jìn)而通過抑制MAPK 通路減緩細(xì)胞的自噬水平及凋亡過程，起到保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞的作用。

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下形成自噬體，并與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，包裹并降解相關(guān)內(nèi)容物，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的能量代謝［5-6］。Beclin 1 是哺乳動(dòng)物中細(xì)胞自噬過程中的重要特異基因，通過調(diào)控自噬的水平發(fā)揮作用；而Casepase 3 是細(xì)胞凋亡中最重要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不可替代的作用［7］。本研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)克龍干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞后，Beclin 1和活化的Casepase 3水平均明顯下降，提示草酸鈣結(jié)石誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡水平受到顯著抑制，進(jìn)而起到保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞的作用。

近些年，氧化應(yīng)激在肝臟腫瘤、心腦血管疾病等模型中被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)自噬，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死［8-10］。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），眾多研究發(fā)現(xiàn)，ROS可通過多種通路抑制自噬過程中的關(guān)鍵分子mTOR激酶的激活，例如MAPK 通路、Akt 通路等［11-12］。已有研究報(bào)道，不同方法抑制氧化應(yīng)激后，MAPK通路可被顯著抑制，進(jìn)而在后續(xù)的病理生理過程中發(fā)揮保護(hù)作用，提示MAPK 通路是氧化應(yīng)激過程中的重要通路之一［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)克龍干預(yù)后降低了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平，抑制了細(xì)胞中MAPK 通路的激活，進(jìn)而抑制了自噬和凋亡水平，提示腎臟草酸鈣結(jié)石形成中，優(yōu)克龍可減緩上述過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)克龍可抑制腎臟草酸鈣結(jié)石的形成，并通過減緩腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激過程，抑制下游的自噬過程與細(xì)胞凋亡水平，實(shí)現(xiàn)抗氧化以及保護(hù)細(xì)胞功能的作用。本研究成果不僅明確了優(yōu)克龍降低草酸鈣結(jié)石形成的作用，并初步揭示了優(yōu)克龍對腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床防治草酸鈣結(jié)石的形成與損傷提供了新的干預(yù)措施。