史曉青，王 玨，丁 穎，陳 銳，朱倩男，查小明

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺病科，江蘇 南京 210029

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥死亡的主要原因［1］。據(jù)報道，5%～10%的乳腺癌具有強(qiáng)遺傳性，且4%～5%的病例是由相對高滲透性（適用于基因突變，是指在特定基因型的情況下發(fā)生諸如乳腺癌或卵巢癌等臨床疾病的可能性）基因以常染色體顯性方式遺傳的［2］。

同源重組修復(fù)（homologous recombination re?pair，HRR）作為一種DNA損傷修復(fù)機(jī)制維持了人類基因組的完整性并確保遺傳信息高保真?zhèn)鬟f［3］，這一過程涉及一大類與DNA 同源重組修復(fù)相關(guān)的基因，若這些基因發(fā)生突變，DNA 損傷得不到及時和正確的修復(fù)，則會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至腫瘤的發(fā)生，稱同源重組修復(fù)缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）［4］。除經(jīng)典的BRCA1/2、TP53 外，HRR 相關(guān)基因還包括ATM、BRIP1、CDH1、CHEK2、NBN、PALB2、RAD51C、RAD51D 等［5］，并與乳腺癌、卵巢癌，胰腺癌及前列腺癌等多種癌癥相關(guān)［6］。目前認(rèn)為，乳腺癌相關(guān)基因表達(dá)的變化遠(yuǎn)早于形態(tài)學(xué)變化［7］。特征性基因表達(dá)譜的檢測能在觀察到腫瘤形態(tài)變化之前對個體罹患腫瘤的風(fēng)險進(jìn)行評估［8］，且越來越多的證據(jù)表明［9-11］，與HRR 相關(guān)基因突變有關(guān)的腫瘤對鉑類化療藥及核糖聚合酶（poly ADP?ribose polymerase，PARP）抑制劑敏感，這對有遺傳性乳腺癌高危因素的患者來說具有重要意義。

本研究以二代測序?yàn)榧夹g(shù)基礎(chǔ)，檢測了102 例患者的HRR 相關(guān)的21 個胚系基因的變異情況，并分析其突變狀態(tài)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理類型及家族史等臨床特征之間的相關(guān)性，旨在為遺傳性乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療提供一定參考。

1 對象和方法

1.1 對象

本研究為單中心回顧性研究，對2018年7 月—2020 年11 月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺病科收治的原發(fā)性乳腺癌病例進(jìn)行篩選。入組標(biāo)準(zhǔn)：①診斷年齡≤40 歲的乳腺癌個人病史；②任何年齡的乳腺癌或卵巢癌家族史（2個或2個以上的血緣近親）；③同時或先后診斷的雙側(cè)乳腺癌或多灶性乳腺癌，且有≥1 個血緣近親有腫瘤病史；④發(fā)病年齡≤60 歲的三陰型乳腺癌；⑤同一個體的乳腺癌和卵巢癌；⑥男性乳腺癌。收集符合以上至少一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)患者的HRR 相關(guān)基因二代測序檢測結(jié)果及臨床病理資料。該研究得到南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

收集患者外周血4 mL，使用乙二胺四乙酸（eth?ylene diamine tetra acetic acid，EDTA）抗凝管于4 ℃儲存并運(yùn)輸，并在3 d 內(nèi)進(jìn)入檢測流程。對外周血標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA 提取并從中取200 ng 進(jìn)行文庫構(gòu)建。HRR相關(guān)基因的整個編碼序列（包括剪接供體和受體位點(diǎn)）經(jīng)雜交捕獲法建庫并由Qubit（Thermo Fisher 公司，美國）及Bioanalyzer（Agilent 公司，美國）檢測合格后，通過高通量測序儀Miseq（Il?lumina 公司，美國）進(jìn)行二代測序檢測，其中文庫構(gòu)建所使用的人多基因突變檢測試劑盒（廣州燃石公司）共檢測21 個HRR 通路基因，包括BRCA1、BRCA2、PTEN、ATR、EMSY、FAM175A、FANCA、FANCI、NBN、MRE11A、ATM、BRIP1、CHEK1、CHEK2、PALB2、RAD50、BARD1、RAD51B、RAD51C、RAD51D 和RAD51L。檢測出變異基因的分類參考了ClinVar（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、BIC（https：//research.nhgri.nih.gov/bic/）、ENIGMA（http：//enigma.ini.usc.edu/）等數(shù)據(jù)庫；根據(jù)2015 版ACMG指南將基因變異的致病性分為5類［12］：致病?5類、可能致病?4類、意義未明?3類、可能良性?2類、良性?1類。本研究將3～5類變異歸入突變組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS25.0 軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述；成組設(shè)計(jì)的兩個率比較時，總數(shù)＞40且任意理論頻數(shù)＞5時，用χ2檢驗(yàn)；總數(shù)＞40且1＜任意理論頻數(shù)≤5時，用校正χ2檢驗(yàn)；總數(shù)≤40或任意理論頻數(shù)≤1時，用Fisher精確概率法檢驗(yàn)；連續(xù)型變量如年齡使用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象整體特征

本研究共納入102例原發(fā)性乳腺癌患者，其中，女101 例，男1 例，年齡20～73 歲，平均年齡42.3 歲。在102 例中，檢測出70 例18 個基因的82 個突變位點(diǎn)，其中51 例發(fā)生單點(diǎn)突變，16 例發(fā)生2 個位點(diǎn)突變，3例發(fā)生3個位點(diǎn)突變（表1）。檢測出的突變基因包括BRCA1、BRCA2、PTEN、ATR、EMSY、FAN?CA、FANCI、NBN、MRE11A、ATM、BRIP1、CHEK1、CHEK2、PALB2、BARD1、RAD51B、RAD51C、RAD51D 和RAD51L，其中BRCA2 基因突變頻數(shù)最多，共有15例，其次為BRCA1（13例）和ATM（11例）（圖1）。從患者腫瘤特征來看，7 例為雙側(cè)乳腺癌，6 例腫瘤為多灶性，7 例腫瘤分子分型存在異質(zhì)性（表1）。

2.2 基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

為了分析HRR 相關(guān)基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系，將102例患者分為未突變、BRCA突變、非BRCA突變3個亞組，分別統(tǒng)計(jì)各組患者年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小、腫瘤雌激素受體（estrogen re?ceptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體?2（human epidermal growth fac?tor receptor?2，Her?2）狀態(tài)，組織學(xué)分級，是否為三陰型乳腺癌及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，其中攜帶包含但不局限于BRCA 突變的患者歸入BRCA 突變組。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)生BRCA 突變及非BRCA 突變的患者與未發(fā)生突變的患者平均年齡相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，發(fā)生突變的兩組患者與未發(fā)生突變的患者比較，未觀察到他們在腫瘤大小，ER、PR、Her?2狀態(tài)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，三陰型乳腺癌例數(shù)，組織學(xué)分級及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 102例患者的臨床病理特征與基因突變狀態(tài)的關(guān)系Table 2 Clinicopathological features of 102 patients and their correlation with gene mutation status

2.3 基因突變相關(guān)危險因素分析

分析了HRR 相關(guān)基因的整體突變和BRCA 基因突變與遺傳性乳腺癌相關(guān)危險因素之間的相關(guān)性。從表3 可以看出，腫瘤家族史、乳腺癌/卵巢癌家族史、三陰型乳腺癌、雙側(cè)乳腺癌、多灶性乳腺癌及男性乳腺癌與HRR 相關(guān)基因整體突變率均無明顯相關(guān)性。而在上述危險因素中，腫瘤家族史（95%CI：0.997～6.142，P=0.047）及乳腺癌/卵巢癌家族史（95%CI：1.227～9.953，P=0.015）則與BRCA 基因突變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性（表4），且與腫瘤家族史相比，我們更有理由相信有乳腺癌/卵巢癌家族史是BRCA基因突變的一個重要危險因素。

表3 HRR相關(guān)基因突變與遺傳性乳腺癌危險因素之間的關(guān)系Table 3 Correlation between HRR gene mutation and clinical risk factors for hereditary breast cancer

2.4 ATM基因突變相關(guān)特征分析

ATM 是除BRCA 外突變率最高的一個HRR 相關(guān)基因（n=11），由此本研究對ATM突變與患者淋巴結(jié)狀態(tài)，ER、PR、Her?2 狀態(tài)，是否為雙側(cè)乳腺癌及是否為多灶性乳腺癌之間的關(guān)系進(jìn)行了分析（表5）。與Her?2 陰性患者相比，ATM 突變更易發(fā)生在Her?2陽性患者中（P=0.045），而ATM與其他臨床病理特征無顯著相關(guān)性。

表5 不同臨床病理特征下ATM的突變狀態(tài)Table 5 Clinical and pathological characteristics of 102 patients with different ATM mutation status

3 討論

乳腺癌發(fā)病率居中國女性惡性腫瘤之首［8］，據(jù)劉繼永等［13］統(tǒng)計(jì)，在江蘇地區(qū)，腫瘤家族史是女性乳腺癌明確的危險因素。攜帶明確遺傳基因突變的遺傳性乳腺癌患者作為一類獨(dú)特群體，他們的臨床病理特征、治療及預(yù)后正被廣泛研究。HRD屬于一種DNA 修復(fù)缺陷，其病因及機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究來看，鉑類及PARP 抑制劑等致DNA 損傷藥物對BRCA1/2 突變腫瘤更為敏感［14-15］，且攜帶其他HRR 相關(guān)基因突變的患者也可能從這類藥物中獲益［16］。本研究以二代測序?yàn)榧夹g(shù)基礎(chǔ)，檢測并分析了入組患者HRR相關(guān)的21種基因的變異情況及其臨床病理特征。

本研究中突變率最高的2 個基因BRCA1 和BRCA2（分別為15%和17%）屬抑癌基因，攜帶該基因突變的患者患乳腺癌的風(fēng)險較一般人群高10～20 倍［17-18］。據(jù)Arpino 等［19］報道，BRCA 陽性患者比散發(fā)性乳腺癌患者年輕得多，并且與BRCA 未突變或散發(fā)性乳腺癌女性相比，ER、PR 或Her?2 陽性的可能性更小。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)，與沒有突變的人相比，攜帶BRCA 突變的患者在初次診斷乳腺癌時更可能有淋巴結(jié)受累，且與乳腺癌相關(guān)的結(jié)局明顯更差。而本研究數(shù)據(jù)分析，并沒有發(fā)現(xiàn)BRCA 突變患者與散發(fā)性乳腺癌患者之間臨床病理特征的差異，可能是由研究對象入組條件不完全一致，研究對象的數(shù)量有差異，對致病性突變的判定標(biāo)準(zhǔn)不同及腫瘤的異質(zhì)性等所致。

腫瘤家族史是乳腺癌的一個重要危險因素，Kuchenbaecker 等［21］研究顯示，BRCA1 和BRCA2 攜帶者的乳腺癌風(fēng)險隨著一級和二級親屬中被診斷有乳腺癌數(shù)量的增加而增加。Wang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，患有癌癥的親戚越多，具有BRCA 突變的先證者比例越高；Mahdavi 等［23］稱，BRCA1/2 的胚系突變是乳腺癌的主要遺傳因素并導(dǎo)致90%的遺傳性乳腺癌病例，建議有乳腺癌/卵巢癌家族史者均應(yīng)盡早進(jìn)行BRCA 基因的篩查。在波蘭有乳腺癌史的家庭中，20%的家庭發(fā)現(xiàn)了BRCA1或BRCA2突變［24］。本研究探討HRR 相關(guān)基因整體突變率及BRCA 突變率與幾個危險因素的相關(guān)性，結(jié)果顯示腫瘤家族史，尤其是乳腺癌/卵巢癌家族史與BRCA 基因突變顯著相關(guān)，且提示了作為遺傳性乳腺癌的重要標(biāo)志物，BRCA 基因相對于整體HRR 相關(guān)基因而言可能更具代表性。

此外，在發(fā)生BRCA1突變的13例患者中，有2例患者攜帶了c.5470_5477del這一位點(diǎn)的突變，這2例患者均有1 例患乳腺癌的親屬（分別是母親和姑姑）。在Wang 等［22］及Lang 等［25］的研究中，BRCA1c.5470_5477del 同樣是最常見的突變位點(diǎn)，提示在中國乳腺癌人群中，這一突變位點(diǎn)的攜帶者占有一定比例。其他突變頻率較高的位點(diǎn)還有ATR c.5899?8del（7/70）及EMSY c.991A＞G（4/70），但并未檢索到這兩個突變位點(diǎn)的相關(guān)研究，且這些突變均屬于3類突變，其臨床意義尚不明確，隨著數(shù)據(jù)庫尤其是中國人群數(shù)據(jù)庫的完善及文獻(xiàn)等資料的更新，未來或許能對這些變異有新的解讀和發(fā)現(xiàn)。

ATM 是除BRCA1/2 外突變率最高的基因。ATM參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和凋亡以及染色質(zhì)重塑過程，最初是根據(jù)其在人類常染色體隱性遺傳疾病共濟(jì)失調(diào)?毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（ataxia?telan?giectasia，AT）中的突變而鑒定出，其功能突變喪失的雜合子攜帶者罹患乳腺癌的風(fēng)險增加［26-27］。病例對照WECARE研究的結(jié)果表明，攜帶可能有害的罕見ATM錯義變體的婦女暴露于放射線可能會增加對側(cè)乳腺癌的風(fēng)險［5］。目前沒有足夠證據(jù)支持?jǐn)y帶致病性ATM突變的乳腺癌患者進(jìn)行放射線治療［28］。本研究數(shù)據(jù)顯示ATM 整體突變率較高，且在Her?2 陽性乳腺癌患者中的發(fā)生率顯著高于Her?2陰性患者（P=0.045）。據(jù)Stagni等［29］研究發(fā)現(xiàn)，ATM作為一個抑癌基因，它的活性狀態(tài)對于Her?2 陽性腫瘤的治療和預(yù)后可能有益，這為Her?2 狀態(tài)與ATM 基因之間的相關(guān)性提供了有力佐證。限于本研究規(guī)模較小，未能得出有關(guān)ATM 更多的結(jié)論，后續(xù)可增加樣本量進(jìn)一步研究。

隨著越來越多的診斷實(shí)驗(yàn)室引入多基因測序技術(shù)，癌癥易感患者的遺傳數(shù)據(jù)逐漸豐富。通過查閱文獻(xiàn)及檢索數(shù)據(jù)庫，專業(yè)醫(yī)生根據(jù)乳腺癌易感基因突變的檢測結(jié)果對其相關(guān)風(fēng)險進(jìn)行評估，并給出相應(yīng)預(yù)防和治療方面的建議。但如本研究數(shù)據(jù)顯示，基因測序會檢測出相當(dāng)一部分意義不明的3 類突變，它們的準(zhǔn)確性和有效性仍然不足，多數(shù)臨床醫(yī)生并不建議對這類患者進(jìn)行臨床干預(yù)，而給這類患者徒增焦慮，這是基因檢測技術(shù)的不足之處。但是，根據(jù)本研究結(jié)果并結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展，建議有腫瘤家族史，尤其是乳腺癌/卵巢癌家族史的遺傳性乳腺癌高危人群應(yīng)盡早進(jìn)行HRR相關(guān)基因（尤其BRCA基因）檢測，以期為這類患者制定更合理的個體化治療方案。若檢測出高滲透性突變但未被診斷乳腺癌的女性，可以考慮采取降低風(fēng)險的策略，如加強(qiáng)監(jiān)測及手術(shù)干預(yù)（包括雙側(cè)乳房切除術(shù)和輸卵管卵巢切除術(shù)）等；若檢測出高滲透性突變并被診斷為乳腺癌的女性，可結(jié)合具體突變基因決定是否使用鉑類及PARP抑制劑等致DNA損傷藥物；攜帶ATM基因突變的患者應(yīng)盡量避免放射線治療。

二代測序技術(shù)日趨成熟使人類遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫逐漸擴(kuò)大，本研究探討了HRR相關(guān)基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系，在豐富乳腺癌患者遺傳資料的同時也提示了對相關(guān)患者進(jìn)行HRR 相關(guān)基因檢測及提供遺傳咨詢的重要性，為必要的預(yù)防及個體化治療提供了一定理論依據(jù)。