洪高英，陳 晨，謝海峰*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，江蘇 南京 210029；2江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029；3江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029；4南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔牙體牙髓科，江蘇 南京 210029

氧化鋯陶瓷是當(dāng)前備受關(guān)注的牙科種植體候選材料之一，但由于生物惰性，難以實(shí)現(xiàn)良好的骨結(jié)合［1-2］。在氧化鋯表面制備生物活性涂層是目前改善氧化鋯表面生物活性的主要方式之一，但遠(yuǎn)期涂層降解、剝脫等問(wèn)題無(wú)法避免［3-5］。因此，化學(xué)改性是一種更可靠的方式。

硅烷是最常見(jiàn)的一類能夠與金屬氧化物結(jié)合的功能性化合物，其在牙科通常應(yīng)用在底涂劑、粘接劑以及復(fù)合樹(shù)脂中［6-7］。硅烷能夠克服氧化鋯表面化學(xué)穩(wěn)定性，與其表面羥基共價(jià)縮合形成Zr?O?Si鍵［8-9］。

此外，親水的氨基、酸酐末端的硅烷已被證實(shí)在修飾氧化石墨烯、鈦、氧化鋯等材料表面具有提高生物相容性和促進(jìn)成骨的作用［10-12］。本研究的目的是比較接枝不同親疏水末端基團(tuán)硅烷的氧化鋯表面對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3?E1生物學(xué)行為的影響，為促進(jìn)氧化鋯種植體早期骨結(jié)合提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3?E1（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），α?MEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、青霉素?鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，美國(guó)）、PBS緩沖液（Hyclone 公司，美國(guó)）、鬼筆環(huán)肽、DAPI（Apexbio 公司，美國(guó)），CCK?8 試劑盒（Dojindo 公司，日本）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京建成生物工程研究所），3?（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γ?MPS）、甲基三甲氧基硅烷（MTMS）、3?巰丙基三甲氧基硅烷（MPTS）、3?氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）（上海阿拉丁公司），酶標(biāo)定量測(cè)試儀（Waltham公司，美國(guó)）、激光共聚焦顯微鏡（LSM 780，CalZeiss AG 公司，德國(guó)）、X 射線能譜（X?ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀（Escalab 250xi，Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）、X射線衍射（X?ray diffraction，XRD）儀（D8 ADVANCE，Bruk?er AXS公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 試件的制備及分組

切割直徑分別為5、13 mm，厚度為1 mm的氧化鋯圓片，所有樣本在使用前分別經(jīng)400、600、800、1 200目的碳化硅紙拋光至鏡面。

實(shí)驗(yàn)分6組（n=6），分別為未處理組（NT組）、堿處理組（HT 組）、γ?MPS 處理組（HT?MPS 組）、MTMS處理組（HT?MTMS 組）、MPTS 處理組（HT?MPTS組）、APTES處理組（HT?APTES組）。氧化鋯圓片先在濃度5 mol/L 的氫氧化鈉溶液中60 ℃下過(guò)夜浸泡，然后分別用γ?MPS（乙烯基末端）、MTMS（甲基末端）、MPTS（巰基末端）、APTES（氨基末端）硅烷溶液處理24 h。所有硅烷溶液的濃度為2%，溶劑為無(wú)水乙醇。硅烷化的樣本分別經(jīng)無(wú)水乙醇、雙蒸水超聲清洗10 min，去除表面未反應(yīng)的多余硅烷，65 ℃烘箱干燥。

1.2.2 XPS分析

通過(guò)XPS 分析評(píng)估表面化學(xué)成分及硅烷化情況。在225 W 下用單色AlKa 輻照（1 486.7 eV）進(jìn)行測(cè)量，入射角為90°。使用XPS Peak 4.1 軟件對(duì)01s譜進(jìn)行分峰處理，用C1（285.0 eV）校準(zhǔn)每個(gè)光譜的結(jié)合能。

1.2.3 掃描電子顯微鏡觀察

各組氧化鋯樣本鍍金后，使用掃描電子顯微鏡在背散射電子模式觀察表面形貌，加速電壓為15 kV。

1.2.4 XRD分析

通過(guò)XRD 在掠入射模式下測(cè)定氧化鋯圓片在硅烷化前后的晶相變化。掃描范圍為20°～80°，掃描速度為0.02°/min。

1.2.5 免疫熒光觀察細(xì)胞黏附及形態(tài)

將各組消毒滅菌后直徑為5 mm的氧化鋯圓片置于96孔板，MC3T3?E1細(xì)胞接種密度為3 000個(gè)/孔，每個(gè)組分別設(shè)置3 個(gè)平行對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用PBS 漂洗2 遍后，使用4%的多聚甲醛溶液固定10 min，PBS 漂洗細(xì)胞2 遍，每孔加入l mL 0.1%Triton?X 100 通透液，然后用稀釋過(guò)的羅丹明?鬼筆環(huán)肽染色40 min 后用PBS 漂洗。每孔加入100 μL稀釋過(guò)的DAPI 染色劑（稀釋比例按說(shuō)明書進(jìn)行），進(jìn)行細(xì)胞核的染色，染色時(shí)間為2 min。將熒光淬滅劑滴到蓋玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察并拍照。

1.2.6 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

使用CCK?8法測(cè)定1、3、5 d 的細(xì)胞數(shù)。將各組消毒滅菌后的直徑為5 mm的氧化鋯圓片置于96孔板，MC3T3?E1 細(xì)胞接種密度為3 000 個(gè)/孔，每個(gè)組分別設(shè)置3 個(gè)平行對(duì)照組。培養(yǎng)到設(shè)定時(shí)間點(diǎn)后，吸去培養(yǎng)基，PBS 沖洗兩遍，向每孔加入100 μL 培養(yǎng)基和10 μL CCK?8 液培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)定量測(cè)試儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.2.7 ALP活性測(cè)定

ALP 是檢測(cè)細(xì)胞早期成骨分化的重要指標(biāo)之一。將各組消毒滅菌后的直徑為13 mm 的氧化鋯圓片置于24 孔板，MC3T3?E1 細(xì)胞的接種密度為1 ×104個(gè)/孔，每個(gè)組分別設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組。培養(yǎng)到設(shè)定時(shí)間點(diǎn)后，吸去培養(yǎng)基，PBS 沖洗兩遍，加入0.1%Triton X?100 500 μL，經(jīng)振蕩后按照ALP測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀560 nm處測(cè)定吸光度值。BCA試劑盒測(cè)量蛋白總濃度并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)材料表面細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及ALP活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XPS結(jié)果

表1為各組氧化鋯試件表面的原子百分比。經(jīng)堿熱處理后試件表面的C 含量減少，O 含量增加。經(jīng)過(guò)硅烷改性的HT?MPS、HT?MTMS、HT?MPTS、HT?APTES 相較NT組和HT組Si含量明顯提高，分別為9.57%、11.48%、9.18%和8.23%。此外，巰基硅烷改性的表面檢測(cè)到4.17%S 元素，氨基硅烷改性的氧化鋯表面檢測(cè)到3.27%N元素。

表1 各組氧化鋯表面元素百分比Table 1 Quantification of the zirconia surfaces in each group（%）

XPS總譜（圖1）結(jié)果顯示，HT?MPS、HT?MTMS、HT?MPTS、HT?APTES 組在346 eV 附近的Zr3p1 峰，332 eV 附近的Zr3p2 峰，180 eV 附近的Zr3d 峰分別出現(xiàn)下降，在102 eV附近出現(xiàn)Si峰。

圖1 氧化鋯試表面硅烷化前后的X射線光電子能譜結(jié)果Figure 1 X?Ray photoelectron spectrum of zirconia sur?face before and after silanization

2.2 SEM結(jié)果

圖2 為各組氧化鋯表面形態(tài)觀察結(jié)果，可見(jiàn)堿熱及硅烷處理并未造成氧化鋯表面腐蝕空隙，表面形貌未發(fā)生明顯改變。

圖2 氧化鋯改性前后表面形貌觀察結(jié)果（×10 000）Figure 2 Scanning electron microscope observation of zirconia surface before and after modification（×10 000）

2.3 XRD結(jié)果

圖3 的XRD 結(jié)果顯示，在29.6°、34.6°、49.8°、59.3°附近觀察到氧化鋯四方相的特征峰［13］，且各組氧化鋯表面晶相未發(fā)生明顯改變。

圖3 氧化鋯表面硅烷化前后的X射線衍射結(jié)果Figure 3 X?ray diffraction patterns of zirconia surface be?fore and after silanization

2.4 細(xì)胞黏附及形態(tài)觀察

MC3T3?E1 細(xì)胞在氧化鋯表面培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行染色，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞黏附及形態(tài)進(jìn)行觀察（圖4）。24 h 免疫熒光染色顯示，HT?MPS組、HT?MTMS 組氧化鋯表面細(xì)胞密度明顯低于NT組、HT 組、HT?MPTS 組、HT?APTES 組。HT 組、HT?MPTS組、HT?APTES組表面的細(xì)胞呈良好的擴(kuò)散和多邊形形態(tài)，細(xì)胞間可見(jiàn)微絲形成的細(xì)胞骨架交通互相聯(lián)絡(luò)，而NT 組細(xì)胞呈平鋪狀態(tài)黏附于氧化鋯表面，HT?MPS 組、HT?MTMS 組細(xì)胞則存在折疊、未鋪展的情況。

圖4 MC3T3?E1細(xì)胞在各組氧化鋯表面培養(yǎng)24 h后的免疫熒光圖像Figure 4 Immunofluorescence staining of MC3T3?E1 cells at 24 h after seeding on zirconia suface

2.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

圖5 為MC3T3?E1 細(xì)胞在各組不同的氧化鋯樣本表面培養(yǎng)1、3、5 d后的細(xì)胞增殖情況。當(dāng)培養(yǎng)到第5 天時(shí)，HT?MPTS、HT?APTES 組的細(xì)胞增殖情況好于NT組，而HT?MPS、HT?MTMS組與NT組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 MC3T3?E1細(xì)胞增殖情況Figure 5 Proliferation of MC3T3?E1 cells

2.6 ALP活性檢測(cè)

圖6 顯示了各組氧化鋯樣本表面MC3T3?E1 細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d 后ALP 的相對(duì)表達(dá)情況。在第7 天時(shí)，HT?APTES 組的ALP 表達(dá)提高，與NT 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)培養(yǎng)14 d 后，HT?MTMS 組、HT?MPTS 組和HT?APTES 組ALP 表達(dá)與NT 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中HT?MPTS組、HT?APTES組ALP呈高表達(dá)，而HT?MTMS組ALP的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降。

圖6 MC3T3?E1細(xì)胞ALP表達(dá)情況Figure 6 ALP protein expression of MC3T3?E1 cells

3 討論

早期骨結(jié)合是影響種植成功的關(guān)鍵因素，而促進(jìn)種植體周圍良好的細(xì)胞生物學(xué)行為和骨結(jié)合在于材料表面形貌及其化學(xué)組成［14-15］。傳統(tǒng)的氧化鋯表面處理通過(guò)噴砂、酸蝕等方式改變表面形貌增加粗糙度，但其會(huì)破壞氧化鋯表面完整性，產(chǎn)生微裂紋，進(jìn)而影響機(jī)械性能［16］。通過(guò)共價(jià)結(jié)合方式長(zhǎng)效穩(wěn)定地改變氧化鋯表面化學(xué)結(jié)構(gòu)，無(wú)疑是一條理想途徑。課題組以往研究已經(jīng)證實(shí)硅烷通過(guò)其一端的烷氧基水解為硅醇后，與氧化鋯表面的羥基共價(jià)縮合形成Zr?O?Si鍵，且硅烷另一端的有機(jī)官能團(tuán)將影響硅烷水解為硅醇的效率，進(jìn)而影響硅烷與氧化鋯之間的化學(xué)親和性［8］。

由于氧化鋯呈化學(xué)惰性，表面羥基含量較少，以往研究證實(shí)通過(guò)紫外線、氧等離子體噴涂、堿化處理等方式均能夠提高氧化鋯表面的羥基密度［17-18］。因此本研究預(yù)先采取堿化處理以提高氧化鋯表面的羥基密度，進(jìn)而接枝硅烷提高硅烷與氧化鋯間的結(jié)合效率。X射線光電子能譜結(jié)果顯示氧化鋯表面經(jīng)堿熱處理后，其表面的C元素下降，O元素含量提高，一定程度上說(shuō)明堿熱處理有效提高了氧化鋯表面的羥基含量。從圖1可見(jiàn)各硅烷改性組在346 eV附近的Zr3p1 峰、332 eV 附近的Zr3p2 峰、180 eV 附近的Zr3d峰分別出現(xiàn)下降，而在102 eV附近出現(xiàn)Si峰，且HT?MPS 組、HT?MTMS 組、HT?MPTS 組、HT?APTES 組氧化鋯表面Si 元素原子百分比分別提高至9.57%、11.48%、9.18%、8.23%，說(shuō)明硅烷有效接枝到氧化鋯表面。在NT 組及HT 組氧化鋯樣本表面同樣檢測(cè)出了少量的Si 元素，這或許是因?yàn)樵谟锰蓟杓堖M(jìn)行拋光處理時(shí)，C、Si 元素殘留在樣本表面。

此外，X 射線衍射結(jié)果證實(shí)堿熱及硅烷處理均不會(huì)破壞氧化鋯表面結(jié)構(gòu)的完整性以及晶相的構(gòu)成，說(shuō)明該處理方式不存在遠(yuǎn)期影響氧化鋯種植體機(jī)械性能的風(fēng)險(xiǎn)。此外，以往文獻(xiàn)報(bào)道具有四方相占比高的光滑氧化鋯表面能夠促進(jìn)MG?63 的細(xì)胞生物學(xué)行為［19］。

材料表面的親疏水性很大程度上影響細(xì)胞的黏附性為，通常認(rèn)為親水性表面有利于細(xì)胞黏附［20］。免疫熒光圖像顯示，在HT、HT?MPTS、HT?APTES 表面的細(xì)胞呈良好的擴(kuò)散和多邊形形態(tài)，細(xì)胞間可見(jiàn)微絲形成的細(xì)胞骨架交通互相聯(lián)絡(luò)，而NT 組細(xì)胞呈平鋪狀態(tài)黏附于氧化鋯表面，HT?MPS組、HT?MTMS組細(xì)胞則存在折疊、未鋪展的情況，并且HT?MPS、HT?MTMS氧化鋯表面細(xì)胞密度明顯低于NT組、HT組、HT?MPTS 組、HT?APTES 組，說(shuō)明不同末端基團(tuán)硅烷改性的氧化鋯表面影響細(xì)胞的早期黏附，其中親水氨基、巰基末端改性的氧化鋯表面對(duì)MC3T3?E1 細(xì)胞的黏附有一定促進(jìn)作用。這可能是由于親水末端硅烷接枝的氧化鋯表面親水性增加，而甲基、乙烯基末端硅烷接枝的氧化鋯表面更加疏水。而HT 對(duì)表面細(xì)胞同樣呈現(xiàn)有利的黏附作用，因?yàn)閴A化處理可使材料表面親水性增加。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第3 天和第5 天時(shí)，HT?MPTS組、HT?APTES組的吸光度值明顯提高，說(shuō)明親水氨基、巰基末端硅烷能夠促進(jìn)MC3T3?E1 細(xì)胞增殖。結(jié)合以往研究酸酐末端改性的鈦表面能夠促進(jìn)Sao?2細(xì)胞增殖［12］，氨基末端硅烷改性的氧化石墨烯表面能夠促進(jìn)人成纖維細(xì)胞HADF、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH?3T3、MG?63等多種細(xì)胞的增殖［10］，或許可以認(rèn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖是親水末端硅烷的共性，而非局限于特定的末端硅烷。MC3T3?E1細(xì)胞的早期分化可以通過(guò)檢測(cè)ALP 的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)。根據(jù)對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)7、14 d后的ALP定量檢測(cè)情況，HT?MPTS和HT?APTES 組吸光度值提高，而HT?MPS 組和HT?MTMS組吸光度值下降，說(shuō)明親水氨基、巰基末端硅烷能夠促進(jìn)MC3T3?E1細(xì)胞分化，疏水甲基、乙烯基末端硅烷抑制其分化，親水末端硅烷促進(jìn)MC3T3?E1細(xì)胞分化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究觀察比較了4種不同親疏水末端硅烷改性的氧化鋯表面對(duì)MC3T3?E1 細(xì)胞黏附、增殖和分化的影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為親水末端硅烷應(yīng)用于氧化鋯種植體表面能夠促進(jìn)早期骨結(jié)合。此外，硅烷作為偶聯(lián)劑不僅單獨(dú)提供活性，其末端的有機(jī)官能團(tuán)能夠與有機(jī)物結(jié)合，提供一個(gè)結(jié)合其他活性成分的平臺(tái)，潛在地拓寬了氧化鋯表面改性的策略，為推進(jìn)氧化鋯種植體的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。