高繼海，李曼嘉，張定堃，裴瑾，馬云桐，彭成

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137)

江油附子是我國典型的道地藥材，其道地性一般被認為是生產(chǎn)技術(shù)主導(dǎo)型，即江油地區(qū)獨特的栽培管理和炮制加工技術(shù)構(gòu)成其道地性的主要內(nèi)涵。江油附子基原植物在品種、品質(zhì)方面與非道地資源存在明顯的差異，自古即認為附子“個大、遵坐正節(jié)角少”和“必正節(jié)、角少、頂細、臍正者為上”，而“頂粗、有節(jié)、多鼠乳者次之，傷缺偏皺者為下”，這種“優(yōu)形優(yōu)質(zhì)”應(yīng)該是江油附子道地性的生物學(xué)基礎(chǔ)。近年來，諸多學(xué)者嘗試從遺傳學(xué)角度探討附子道地性的形成機制，但始終未有實質(zhì)性突破。

系統(tǒng)中藥學(xué)是中醫(yī)藥現(xiàn)代化階段的繼承和創(chuàng)新性思想，它將中藥體系自身、中藥的生態(tài)環(huán)境和中藥作用的機體對象均闡釋為復(fù)雜體系，要認識和研究這3個復(fù)雜體系，就必須在復(fù)雜系統(tǒng)科學(xué)理論和方法的指導(dǎo)下，應(yīng)用多維評價的方法，探究這些復(fù)雜系統(tǒng)及相互間的關(guān)鍵要素、結(jié)構(gòu)、功能和關(guān)聯(lián)，揭示其科學(xué)內(nèi)涵[1-2]。系統(tǒng)中藥學(xué)為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供了思想支撐，尤其為道地性遺傳學(xué)機制還未清楚的中藥資源研究帶來了曙光。本文在系統(tǒng)中藥思維指導(dǎo)下，通過梳理多領(lǐng)域和系列交叉學(xué)科的研究成果，進行系統(tǒng)性綜合，嘗試為江油附子的遺傳道地性提出研究方向和切入點。

1 烏頭的植物系統(tǒng)學(xué)

附子入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“附烏頭而生者為附子，如子附母也”，現(xiàn)代藥典將其基原界定于植物學(xué)上的烏頭(Aconitumcarmichaelii)單一物種，其母根干燥加工品為中藥川烏，子根干燥加工品為附子。附子道地性的遺傳成因，本質(zhì)上是烏頭的種質(zhì)形成問題。

1.1 毛茛科植物的親緣演化

毛茛科傳統(tǒng)上被認為是被子植物的原始類群之一，全世界有超60屬2 000余種，我國有42屬約720種。在APGII系統(tǒng)中，毛茛科植物與小檗科(Berberidaceae)親緣關(guān)系最為接近而成姊妹類群，并依次與領(lǐng)春木科(Eupteleaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、星葉草科(Circaeasteraceae)、木通科(Lardizabalceae)和防己科(Menispermaceae)分化，它們一起歸于毛茛目(Ranunaculales)、木蘭亞綱(Magnoliidae)。而在毛茛科植物中，分化順序又依次為白根葵亞科(Glaucidioideae)、白毛茛亞科(Hydrastidoideae)、黃連亞科(Coptidoideae)、唐松草亞科(Thalictroideae)、毛茛亞科(Ranunculoideae)，這些類群在白堊紀后期輻射演化快速形成了幾乎所有族的祖先[3-5]。而在族及以下分類單位，毛茛科演化出了難于解析并爭議較大的多分支。

1.2 烏頭屬植物的親緣演化

烏頭屬是毛茛科中物種最為豐富的屬，全世界約400種，全部分布在北半球，我國發(fā)現(xiàn)近170種。烏頭屬植物根據(jù)地下部分劃分為3個亞屬：牛扁亞屬(Subgen.Paraconitum，多年生直根)、露蕊烏頭亞屬(Subgen.Gymnaconitum，一年生直根)和烏頭亞屬(Subgen.Aconitum，多年生塊根)[6]。

烏頭屬的外部形態(tài)演化大致為：地下部分從多年生到二年生和一年生；葉的分裂程度從小到大，從掌狀深裂到掌狀全裂，一回裂片從淺裂到細裂；上萼片從船形到盔形、高盔形、圓筒形；花瓣的瓣片從小發(fā)展到較大，從分化程度小到分化成明顯的唇和由短到長的距；種子表面從平滑到出現(xiàn)膜質(zhì)橫翅。

烏頭屬的花器官具有典型的自交不親和特征，主要表現(xiàn)為合子前自交不親和，而早期近交衰退現(xiàn)象不明顯[7-8]。異花授粉、異株授粉均可正常結(jié)籽，傳粉方式有風(fēng)媒、蟲媒，而以前者為主，植物的居群密度對傳粉效率至關(guān)重要[9-10]。種子形態(tài)有較大的區(qū)別[11]，后熟現(xiàn)象嚴重，通常無法自然萌發(fā)。

1.3 烏頭的親緣演化

烏頭是本屬乃至本科中分布最為廣泛、性狀最豐富、應(yīng)用最多的物種[12-13]。除本種烏頭外，《中國植物志》中記載的四個亞種，它們的分化尚存爭議，但公認烏頭屬植物在種下水平依然發(fā)生著劇烈的分化，其中毛葉烏頭(A.carmichaelivar.pubescens)的葉子多毛，黃山烏頭(A.carmichaelivar.hwangshanicum)葉片的中央裂片狹長、花序軸?？s短，深裂烏頭(A.carmichaelivar.tripartitum)的葉分裂不達基部、葉基部呈寬心形或截狀心形，以上三變種的花序和烏頭一樣都有反曲并貼伏的短柔毛，而展毛烏頭(A.carmichaelivar.truppelianum)的花序軸和花梗，以及萼片外面都有開展的直毛。四個亞種間又有過渡類型，如有些展毛烏頭與烏頭間的過渡類型為花序毛離軸稍展開一點，可沒到與軸成直角開展的程度。

葉形是烏頭屬和烏頭下級分類的重要依據(jù)[14-16]，也是中藥附子品種培育的基礎(chǔ)[17-18]。在栽培產(chǎn)地，烏頭的葉形品種有南瓜葉、大花葉、小花葉、鵝掌葉、莓葉子、油葉子和冒氏苗等。從傳統(tǒng)分類學(xué)角度，小花葉(尤其是其中的艾葉形)在進化等級上高于淺裂的瓜葉(尤其是南瓜葉)。

1.4 烏頭的地理分布與環(huán)境影響

烏頭是中國分布最廣的屬內(nèi)物種，自川藏高原東緣起向東至長江中、下游以及珠江流域上游各省區(qū)的丘陵地區(qū)，從江蘇向北經(jīng)過山東到達遼寧南部均有分布，海拔范圍達到100～3 000 m之廣。附子的栽培地集中在四川、陜西、云南等省區(qū)，這些地區(qū)的野生烏頭既是極為重要的種質(zhì)資源，又是栽培用種的來源，部分地方還直接入藥。

烏頭的生境適宜性研究發(fā)現(xiàn)四川盆地北部山區(qū)、西緣龍門山地和西南山地是廣泛的氣候生態(tài)適宜區(qū)，東向盆地中部山丘陵和東部平行嶺谷，及西向川西高山高原，氣候生態(tài)適宜性漸減[17,19]。中國的烏頭生態(tài)適宜區(qū)有十余個省市，相似度95%～100%區(qū)域有四川、云南、河南、湖北等省，其中面積較大的區(qū)域包括四川省和云南省，面積分別為327 km2和276 km2[20]。通過對種植產(chǎn)區(qū)生態(tài)因子和栽培方式的研究分析[21]，發(fā)現(xiàn)土壤可能是影響烏頭分布的主導(dǎo)因素[22]。

2 烏頭的分子系統(tǒng)學(xué)

2.1 烏頭屬的分子系統(tǒng)學(xué)

自上世紀90年代起，分子系統(tǒng)學(xué)在毛茛科的研究中廣泛開展，許多分子序列被用于毛茛科分類鑒定，一方面為毛茛科的系統(tǒng)發(fā)育研究提供了有效信息，另一方面也給傳統(tǒng)分類帶來了很多變化。使用過的分子標簽有同位酶雜交多態(tài)性、RFLP、ISSR、內(nèi)基因間隔區(qū)(cpDNA IGS) 多態(tài)性技術(shù)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、26S，以及葉綠體上的系列基因，以核基因+葉綠體基因的2～3個序列復(fù)合使用為主，該方法使人們深入認知了烏頭屬的系統(tǒng)演化。

烏頭屬的3個亞屬中，分子系統(tǒng)研究表明露蕊烏頭亞屬應(yīng)為獨立的單系類群，且可能更原始于其他兩亞屬。牛扁亞屬相對烏頭亞屬較為原始，這與其性狀、化學(xué)，以及染色體以二倍體為主等特征相符。學(xué)者近期甚至發(fā)現(xiàn)了牛扁亞屬有染色體組基數(shù)6的物種(A.fletcheranum)[23]，進一步表明其比染色體組基數(shù)為8的其他物種原始。烏頭亞屬與牛扁亞屬植物間的遺傳差異并不大，兩類群早期可能發(fā)生雜交現(xiàn)象，而性狀上的較大差異應(yīng)是近期分化的結(jié)果。例如，藍色花系的烏頭亞屬與黃色花系的牛扁亞屬雜交，演化了大量中間花色的物種[24]。綜合分子系統(tǒng)學(xué)與地理譜系研究結(jié)果[25]，毒虱花屬(Staphisagria)植物最早約于漸新世32.3 Ma前從毛茛科翠雀族分化出，然后29.61 Ma前左右露蕊烏頭(亞)屬形成。烏頭屬與翠雀屬的分支演化約發(fā)生于27.24 Ma前，按照各自路線繁衍至今[26]。在烏頭屬植物一支，約于12.68 Ma前的亞洲地區(qū)演化出牛扁亞屬、烏頭亞屬，兩者分別于5.27 Ma、7.75 Ma前開始遺傳擴張，尤其烏頭亞屬植物分別于3.3Ma、0.9 Ma向北美和地中海地區(qū)發(fā)生了擴張事件。

值得注意的是，烏頭亞屬的染色體倍性較為復(fù)雜，呈現(xiàn)出四倍體(2n=32)、六倍體(2n=48)和八倍體(2n=64)混合的現(xiàn)狀，其染色體形狀、大小與牛扁亞屬植物(以二倍體、四倍體為主)有明顯區(qū)別，這一方面成為兩屬植物進化關(guān)系的評判依據(jù)，即烏頭亞屬具備適應(yīng)更復(fù)雜生境的遺傳進化優(yōu)勢，另外也啟發(fā)了現(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)的研究方向。近年針對烏頭屬葉綠體基因組比較發(fā)現(xiàn)，烏頭亞屬比牛扁亞屬的葉綠體基因組總長度稍小，長序列單拷貝區(qū)(LSC)、短序列單拷貝區(qū)(SSC)、長片段反向重復(fù)序列(IR)結(jié)構(gòu)與蛋白編碼基因數(shù)量均有趨勢性差異[27]。

2.2 烏頭的分子系統(tǒng)學(xué)

在烏頭屬內(nèi)，烏頭為分化較晚的物種，與日本烏頭(A.japonicum)、卷毛蔓烏頭(A.ciliare)、北烏頭(A.kusnezoffii，四倍體)聚為一群，向古追溯又依次與蔓烏頭(A.volubile，二倍體)、鴨綠烏頭(A.jaluense，四倍體)、A.chiisanense、A.austrokoreense、高山烏頭(A.monanthum，四倍體)具有親緣關(guān)系[28-30]。葉綠體和核基因兩方面的證據(jù)都顯示蔓烏頭(2n=2x=16)參與了東亞烏頭屬四倍體物種形成，可能是東亞四倍體類群的祖先之一[31]。這種通過雜交產(chǎn)生高倍化物種的現(xiàn)象也發(fā)生在牛扁亞屬[27,32]。

烏頭四個亞種的分類與分化目前尚存爭議，但公認其種下水平依然發(fā)生著劇烈的分化。毛葉烏頭可能存在四倍體和六倍體[8,15]，黃山烏頭為四倍體，深裂烏頭為四倍體，展毛烏頭的倍性不清。通過葉綠體單倍型研究，推測西南地區(qū)的烏頭原變種可能是由黃山烏頭和深裂烏頭兩個變種雜交而來，黃山烏頭為母本提供葉綠體基因組，而深裂烏頭為父本，而作為古代道地藥材的基原植物，其核心種質(zhì)可能主指原變種和毛葉烏頭[33]。值得中藥學(xué)者關(guān)注的是，高產(chǎn)的八倍體烏頭，目前只發(fā)現(xiàn)于栽培產(chǎn)區(qū)的四川、云南，這兩地是中國附子的道地產(chǎn)區(qū)，這種道地性的形成與多倍化的演化是否存在相關(guān)性，很值得深入探索。

2.3 烏頭的遺傳多倍化與道地性

烏頭屬物種均有自然演化的相對固定的生態(tài)分布區(qū)段，遺傳多倍化與耐寒是烏頭屬演化等級高的特征。綜合遺傳演化資料，海拔高度與烏頭屬植物的分布有諸多關(guān)聯(lián)[24]，低海拔區(qū)多有二倍體種質(zhì)，這類植物能夠正常結(jié)籽和有性繁殖，至高海拔區(qū)段則演化為四倍體乃至最高的八倍體。八多倍化演化的結(jié)果，使得遺傳物質(zhì)增加，次級代謝產(chǎn)物也更為豐富(藥材品質(zhì)提升)[6,34-35]，適應(yīng)高寒惡劣生境的能力也提高。

烏頭染色體高倍化產(chǎn)生的性狀特征，又影響了附子道地栽培技術(shù)的形成。在發(fā)育問題上，烏頭的營養(yǎng)器官更容易培養(yǎng)肥大。在種子問題上，除了自交不親和普遍規(guī)律外[9,36]，多倍化還使得烏頭配子發(fā)育紊亂的概率提升，導(dǎo)致種子敗育[37-39]。在生殖問題上，高倍體物種自然演化出了地下繁殖器官。烏頭利用地下根狀組織延續(xù)物種和居群生存的模式是假一年生(周期為2 年)模式[25]，這是比根狀莖(多年生)演化高等的模式[26,34]。傳統(tǒng)生理發(fā)育研究認為烏頭的側(cè)生塊根(生附子)實為其更新芽，主要發(fā)育自植株的莖基部第一節(jié)(葉)位置。然據(jù)筆者多年實踐栽培發(fā)現(xiàn)，烏頭在秋冬季莖桿枯死過程中，凡埋土下的多節(jié)莖節(jié)部位均能發(fā)育出側(cè)根，可見其無性繁殖的效率非常高。針對屬內(nèi)其他物種的研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)生芽(側(cè)根)發(fā)育過程中，某些淀粉合成、光合作用、激素調(diào)控及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因共同發(fā)揮了重要作用[40]。

因此，筆者認為烏頭屬乃至毛茛科中只有烏頭演化出了八倍體，且其八倍化事件只發(fā)生于中國的川西、滇西北地區(qū)，以至于被古蜀人民樸素選種為道地種植藥材，筆者認為這是破解中藥附子道地性遺傳機制的切入點，這個觀點還有待于深入研究與考證。近年，隨著基因組全序列檢測成本的加速降低，核基因組與葉綠體基因組正成為系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的有效手段。這種大組學(xué)研究的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù)，反向重復(fù)區(qū)域都為單拷貝基因，較少受到平行演化和回復(fù)突變影響，幾乎不會受到旁系同源的影響，能夠更真實地反映出物種真實的演化歷史，其與植物系統(tǒng)學(xué)結(jié)合，將成為解決藥用植物烏頭的生物學(xué)起源和中藥附子遺傳道地性形成的最有效途徑。