尚華 劉博 趙曉東 胡寧 戚誠

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2014年我國肝癌新發(fā)病例 36.5萬例，肝癌新死亡病例約 31.9萬例[1]。肝切除術(shù)是早期肝癌的首選治療方法，但肝癌早期診斷困難，患者就診時多屬中晚期，失去手術(shù)機會。對于不可切除的肝癌，治療方法有局部消融治療、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)(transarterial chemoembolization，TACE)、放射治療和全身治療[2]。雖然肝癌的治療手段多樣，但療效有限，5年相對生存率僅12.1%[3]。作為抑癌基因，p53與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，p53基因治療制品也已在臨床使用多年。本研究聯(lián)合不同作用機制的治療方式，探討TACE聯(lián)合p53基因治療和射頻消融用于肝癌治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔26只，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供[實驗動物合格證號：SYXK(冀)2018-008]。

1.2 材料與儀器 超液態(tài)碘油(法國Guerbet公司)，Ad-p53(深圳賽百諾基因技術(shù)有限公司)，p53抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，射頻治療儀[安雋醫(yī)療科技(南京)有限公司]，CT機(西門子股份有限公司)，生物光學(xué)顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.3 模型建立和動物分組 VX2腫瘤株復(fù)蘇后800 r/min離心5 min，去除上清液后加入 PBS 液繼續(xù)離心5 min，去除上清液后再次加入PBS液，玻璃棒攪勻，取懸液進(jìn)行臺盼藍(lán)染色計數(shù)，將細(xì)胞液濃度調(diào)至109個/L。隨機選取2只大白兔作為腫瘤傳代兔，取VX2瘤細(xì)胞懸液0.5 ml接種于兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)，2周后待瘤體細(xì)胞發(fā)育完成，取出瘤體，剔除肌肉組織和壞死組織，將瘤體組織剪成約 1 mm3大小的碎塊浸泡于0.9%氯化鈉溶液中備用。24只擬荷瘤兔全麻后無菌條件下逐層開腹，眼科剪刺破肝左葉較厚處，剪開約5 mm深度的“燒瓶樣”竇道，直接植入2～3塊瘤體組織，明膠海綿填埋瘺口，逐層關(guān)腹。術(shù)后3 d肌內(nèi)注射青霉素105 U·kg-1·d-1預(yù)防感染。術(shù)后14 d行CT檢查，觀察腫瘤生長情況，計算腫瘤體積。24只成功建模的實驗兔隨機分為A、B、C組進(jìn)行后續(xù)治療。(1)A組(8只)：第1天瘤內(nèi)注射rAd-p53(5×106/VP)，經(jīng)肝動脈灌注超液態(tài)碘油(0.5 ml/只)，第2天射頻消融(治療時間5 min，功率135 W)；(2)B組(8只)：第1天經(jīng)肝動脈灌注rAd-p53(5×106/VP)和超液態(tài)碘油(0.5 ml/只)，第2天射頻消融(治療時間5 min，功率135 W)；(3)C組(8只)：經(jīng)肝動脈灌注超液態(tài)碘油(0.5 ml/只)，第2天射頻消融(治療時間5 min，功率135 W)。

1.4 檢測指標(biāo) 治療后第3天檢測p53蛋白表達(dá)量。治療后1、2、3、4周行CT檢查，觀察腫瘤生長情況，計算腫瘤體積。最后處死實驗兔，觀察腫瘤大小及壞死情況并對標(biāo)本行HE染色。治療前、治療后1 d、3 d、1周和2周，兔耳緣靜脈采血2～3 ml行肝功能檢查，比較治療前后各時間點血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)兩項指標(biāo)變化情況。

1.5 Western blot檢測p53水平 治療后第3天，細(xì)針針吸法取肝癌中心組織，粉碎，用含蛋白酶抑制劑的RIPA-buffer提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，顯色，定影，顯影。以β-actin為內(nèi)參蛋白，以目標(biāo)蛋白吸光度與內(nèi)參蛋白的比值表示目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

1.6 免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟水化,乙醇浸泡，蘇木精染色，鹽酸乙醇分色，自來水洗，伊紅染色，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué) 術(shù)后組織形態(tài)觀察，肝癌組織標(biāo)本壞死灶為類橢圓形，呈灰白色，邊界清晰，與周圍組織間有纖維包膜，瘤體中央可見凝固性壞死，部分液化。其中C組組織標(biāo)本的毀損中心區(qū)較A組和B組略小，邊緣均有腫瘤殘存。HE染色顯示大片凝固性壞死，凝固性壞死區(qū)周圍有包膜形成。見圖1。

圖1 凝固性壞死區(qū)(HE×200)

2.2 3組腫瘤體積比較 經(jīng)治療后，A組和B組腫瘤體積呈持續(xù)縮小趨勢，C組腫瘤體積在治療后的前2周先縮小，治療后3周逐漸恢復(fù)增長。治療后1周3組腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療后2、3、4周A組和B組腫瘤體積均較C組小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同時間腫瘤體積比較

2.3 3組治療ALT水平比較 治療前3組瘤兔肝功能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療后1 d 3組ALT水平均達(dá)到峰值，較治療前顯著升高，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后3 d、治療后1周及治療后2周3組的ALT在治療后1 d的基礎(chǔ)上持續(xù)下降，其中A組和B組的下降趨勢更顯著，治療后3 d和治療后1周時，A組和B組的ALT水平較C組更低，治療后2周時A組和B組ALT基本恢復(fù)至術(shù)前水平，且低于同期C組水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組治療前后ALT變化

2.4 3組治療前后AST水平比較 治療前3組的AST比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組在治療后1 d、3 d及1周后，AST水平均較治療前高(P<0.05)，治療后2周，A組和B組基本恢復(fù)至術(shù)前水平，但C組仍顯著高于治療前，明顯高于A、B組(P<0.05)。見表3。

表3 3組治療前后AST水平比較

2.5 3組p53蛋白表達(dá)比較 A組和B組p53表達(dá)明顯低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 p53蛋白表達(dá)

表4 3組p53蛋白表達(dá)比較

3 討論

肝癌是我國第四位常見的惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌，對人民生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。肝癌患者就診時多為中晚期，失去手術(shù)機會，局部消融治療、TACE、放療和全身治療是不適合外科手術(shù)的進(jìn)展期肝癌的首選方法。TACE是公認(rèn)的最常用的肝癌非手術(shù)治療方法之一，尤其是TACE與局部消融治療聯(lián)合應(yīng)用，協(xié)同效應(yīng)明顯，逐漸替代TACE單一治療模式，但對中晚期肝癌患者生存率的改善仍有限[2]。近年來，基因治療迅猛發(fā)展，陸續(xù)有多項基因治療產(chǎn)品上市，與傳統(tǒng)療法相比，基因治療更有針對性，有望成為當(dāng)前惡性腫瘤生物治療的主要手段[4]。

p53是一種腫瘤抑制基因，主要參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，人類 p53基因所編碼的蛋白有野生型(wtp53)和突變型(mtp53)兩種形式, wtp53可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，50%的惡性腫瘤存在p53基因的突變[5]。mtp53能與wtp53形成復(fù)合物，使wtp53與DNA結(jié)合能力下降，與這些結(jié)合位點相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)受影響，最終引起癌細(xì)胞生長失控[6]。

p53應(yīng)用于惡性腫瘤基因治療是以野生型 p53基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，以替代突變型p53基因。本研究中使用的rAd-p53是以5型腺病毒為載體，與人野生型p53進(jìn)行基因重組形成有活性的基因工程重組腺病毒顆粒，通過外源性導(dǎo)入野生型p53基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，臨床上被批準(zhǔn)與放射治療聯(lián)合可試用于現(xiàn)有治療方法無效的晚期鼻咽癌的治療[7]。p53基因經(jīng)肝動脈灌注化療治療中晚期肝癌與未聯(lián)合使用p53基因相比，總緩解率更高并有效縮小腫瘤直徑[8]。

肝細(xì)胞癌90%以上的血供來自肝動脈，通過TACE可切斷病灶主要血供，使腫瘤發(fā)生缺血、缺氧并壞死，結(jié)合射頻消融術(shù)的輔助治療下，局部組織溫度升高也可使腫瘤細(xì)胞凝固性壞死[9]。本研究中，治療前3組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)治療后，不同治療方式下腫瘤體積呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。治療后的前2周3組腫瘤均出現(xiàn)縮小，在第2周開始腫瘤體積差異開始體現(xiàn)，治療后第3周，C組(碘油灌注聯(lián)合射頻消融)腫瘤恢復(fù)增長，而rAd-p53給藥下腫瘤體積持續(xù)縮小，治療后第4周，C組腫瘤體積在2周基礎(chǔ)上繼續(xù)增加，而2個rAd-p53給藥組治療效果仍持續(xù)，腫瘤體積未出現(xiàn)增加。表明rAd-p53聯(lián)合超液態(tài)碘油TACE和射頻消融較未使用rAd-p53相比對VX2肝癌治療效果更好。根據(jù)rAd-p53使用說明書，動物體內(nèi)注射后1 h重組腺病毒顆粒即可進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；注射后3 h，p53基因開始表達(dá)；第3天達(dá)到高峰，3周后，細(xì)胞內(nèi)重組腺病毒DNA被降解[10]。說明p53基因表達(dá)可持續(xù)3周，本研究中，rAd-p53給藥組在治療后4周仍保持對腫瘤體積的控制，體積變化規(guī)律與藥代動力學(xué)特點具有一定一致性。水化碘油為含碘油劑，經(jīng)肝動脈灌注后能長期滯留于腫瘤組織內(nèi)，正常肝組織內(nèi)則數(shù)天后就消失。水化碘油作為抗腫瘤藥物的載體，可提高藥物濃度、使藥物緩慢釋放，延長藥物作用時間[11]。本研究中，2個rAd-p53給藥組，在治療后4周仍繼續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用，可能是由于碘油栓塞局部靶血管的同時，延長了p53基因在肝動脈和瘤體局部的停留時間，持續(xù)保持基因有效濃度，從而發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、縮小腫瘤體積的作用。

ALT和AST是評價肝臟代謝功能的指標(biāo)，本研究中，治療后1 d，ALT和AST均顯著升高，由于3組均采用了TACE，介入治療通過對腫瘤組織主要供血動脈進(jìn)行栓塞，肝動脈及其分支動脈暫時性缺血，進(jìn)而造成肝細(xì)胞的腫脹、缺血、缺氧，射頻消融的高溫引起肝臟毛細(xì)血管和膽管通透性增加，與肝功能相關(guān)的各種酶從細(xì)胞內(nèi)釋放入血[12,13]，血清ALT和AST水平出現(xiàn)明顯的上升。而3組間ALT和AST水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明無論是灌注碘油還是rAd-p53，對肝臟造成的一過性損傷是類似的。治療后3 d開始，ALT和AST水平下降，肝功能逐漸恢復(fù)，至治療后2周，A組和B組基本恢復(fù)至術(shù)前水平，以上數(shù)據(jù)說明，隨著時間的推移，肝臟在因介入栓塞治療和射頻消融損傷后，肝功能將逐漸恢復(fù)，且rAd-p53對肝功能的恢復(fù)可能有促進(jìn)作用。wtp53半衰期僅1～2 h,正常細(xì)胞內(nèi)水平低，而mtp53半衰期較長，達(dá)2～12 h,因此通常是檢測mtp53水平[14]。本研究選擇在p53基因表達(dá)高峰期比較表達(dá)差異，Western blot檢測陽性表明了3組肝癌模型均存在不同程度的p53基因突變，A組和B組p53表達(dá)明顯低于C組，說明給予rAd-p53后，突變型p53蛋白相對表達(dá)量下降。結(jié)合3組腫瘤體積變化規(guī)律，從分子學(xué)水平表明了p53蛋白表達(dá)與抗腫瘤療效有相關(guān)性。

瘤內(nèi)注射是rAd-p53的常規(guī)給藥方式，而已有的關(guān)于p53基因治療與TACE聯(lián)用則多采用動脈介入灌注的方式[15]，本研究中rAd-p53瘤內(nèi)注射和動脈灌注兩種不同給藥方式下的對腫瘤大小的影響并不明顯，p53蛋白表達(dá)差異也不顯著，說明p53基因兩種給藥方式對療效影響不大，但與碘油聯(lián)用時p53基因動脈灌注給藥便利性更高，且考慮介入途徑下給藥免疫反應(yīng)可能較瘤內(nèi)直接注射低，所以肝動脈灌注p53基因更具優(yōu)勢。

綜上所述，p53基因聯(lián)合TACE和射頻消融在兔VX2肝癌模型中療效肯定。本課題組也考慮從分子學(xué)水平考察p53基因治療影響腫瘤生長的機制，以及安全性等指標(biāo)，從而為用于p53基因聯(lián)合TACE和射頻消融用于肝癌治療提供充足依據(jù)。