宋玉霞 趙芳 趙濤 周莎莎 王雪娟 郭樺

卵巢癌(Ovarian cancer)是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占女性生殖系統(tǒng)腫瘤第三位，病死率居于首位[1]。據(jù)中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年我國新發(fā)病例5.21萬例，因卵巢癌死亡病例2.25萬例[2]。卵巢癌患者早期沒有典型的臨床癥狀及特異性的標(biāo)記物，約70%的患者明確診斷時已為晚期；近年來以手術(shù)為主的綜合治療的技術(shù)有很大提高，然而其5年生存率仍徘徊在30%左右[3]。目前對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，以及卵巢癌細(xì)胞如何擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官的分子機(jī)制并不明確，探討其機(jī)制的研究對卵巢癌的預(yù)防、早期診斷、綜合治療及預(yù)后都具有非常重要的現(xiàn)實意義。平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22 alpha，SM22α)又稱為Transgelin，是一種actin細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，通過與細(xì)胞骨架的肌動蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮功能[4]。SM22α作為信號分子參與細(xì)胞的分化、生長及細(xì)胞外基質(zhì)重塑等[5,6]。研究表明，M22α可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起作用，其在多種癌組織中，如肺癌[7]、乳腺癌[8]、大腸癌[9]等，表達(dá)下調(diào)或降低。此外，SM22α還可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。本研究應(yīng)用qRT-PCR和Western blot方法檢測卵巢癌組織中SM22α的表達(dá)情況，探討其在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年12月至2018年12月石家莊市第一醫(yī)院婦科手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織標(biāo)本43例?；颊吣挲g28～72歲，平均年齡53.4歲，所有患者均為初治行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)前均未行新輔助化療，標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理確診。組織學(xué)類型：漿液性腺癌31例、黏液性囊腺癌4例、子宮內(nèi)膜樣癌8例；FIGO 手術(shù)病理分期：Ⅰ期7例、Ⅱ期3例、Ⅲ期29例、Ⅳ期4例；組織分級：1～2級23例、3級20例。對照組標(biāo)本選取同期因?qū)m頸癌或子宮肌瘤行全子宮雙附件切除患者的卵巢組織50例，對照組患者術(shù)中證實無卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫或卵巢腫瘤等，術(shù)后病理診斷為正常卵巢。標(biāo)本均在離體后30 min內(nèi)收集，迅速放入-80℃冰箱里低溫保存?zhèn)溆?。?biāo)本和資料收集均由患者本人知情同意，并獲得石家莊市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR 引物(上海生工生物工程有限公司)；RevertAid cDNA 合成試劑盒(TaKaRa生物技術(shù)有限公司)；QuantinovaTMSYBR? green pcr Kit(上海凱杰生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR儀(7500 型)為美國ABI公司產(chǎn)品；兔抗人SM22α單克隆抗體(Ab-cam公司)；兔抗人單克隆抗體GAPDH(Santa Cruz生物有限公司)；熒光標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(Santa Cruz生物有限公司)；雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 總RNA提取及qRT-qPCR 應(yīng)用：TRIzol RNA提取試劑盒按照說明書操作提取組織總RNA，Nanodrop2000檢測總RNA的濃度及純度，要求OD260/OD280值位于1.8～2.0。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作將5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將轉(zhuǎn)錄好的cDNA于-20℃冰箱保存，用于后續(xù)qPCR擴(kuò)增。應(yīng)用QuantiNovaTMSYBR? Green PCR 試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系：Green Master Mix 1.0 μl、上游引物 1.4 μl、下游引物 1.4 μl、Rox 0.1 μl、模板cDNA 1.0 μl、最后加雙蒸水至20 μl。qPCR反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)行40個循環(huán)(95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s)；最后進(jìn)行95℃變性15 s、58℃退火60 s、95℃延伸30 s。反應(yīng)引物序列：目的基因SM22α的上游引物 5’-AGGTGTGGCTGAAGAATGGCG-3’、下游引物 5’-TCTTCGTCTACATAATCCTC-3’；內(nèi)參GAPDH的上游引物 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。根據(jù)系統(tǒng)生成的Ct值，采用2-ΔΔCT法計算獲得SM22α基因mRNA的相對表達(dá)量，每個標(biāo)本均設(shè)3個副孔，取平均值。

1.3.2 Western blot檢測SM22α蛋白表達(dá)情況:解凍卵巢癌組織及正常卵巢組織標(biāo)本后，取約200 mg用眼科剪將組織塊剪碎后加入蛋白裂解液，組織充分裂解后，4℃離心機(jī)上離心提取總蛋白，用定量BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備10% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠，每加樣孔上樣50 μg樣本蛋白，電泳90 min后將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2 h，TBST洗膜后加稀釋好的一抗(兔抗人SM22α單克隆抗體1∶1 000；兔抗人單克隆抗體GAPDH 1∶800)、4℃條件下過夜。TBST洗膜3次后加二抗(熒光標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體1∶10 000)室溫避光孵育1 h，TBST再次洗膜4次后抗體結(jié)合區(qū)帶用Odyssey雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)進(jìn)行成像。

2 結(jié)果

2.1 SM22α在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)情況 利用qRT-PCR檢測43例卵巢癌組織及50例正常卵巢組織中SM22α mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：卵巢癌組織中SM22α mRNA相對表達(dá)水平為(0.72±0.18)，正常卵巢組織中其相對表達(dá)水平為(1.45±0.63)，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果同樣顯示：與正常卵巢組織相比，SM22α在卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 SM22α蛋白表達(dá)情況;N：正常卵巢組織，Ca：卵巢癌組織

2.2 SM22α在卵巢癌組織中mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 采用Pearson Correlation Coefficients檢驗，分析結(jié)果顯示：卵巢癌組織中SM22α mRNA表達(dá)水平與其蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.701,P<0.05)，表明卵巢癌組織中SM22α mRNA和其蛋白表達(dá)趨勢一致。見圖2。

圖2 卵巢癌組織中SM22α基因的mRNA與蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.3 SM22α基因mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 應(yīng)用t檢驗將SM22α 基因mRNA表達(dá)水平與EOC患者各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示淋巴轉(zhuǎn)移陽性患者的癌組織中SM22α基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于淋巴轉(zhuǎn)移陰性患者的癌組織(P<0.05)，而其mRNA表達(dá)水平與患者年齡、臨床分期、組織學(xué)分級、腫瘤病理學(xué)類型、手術(shù)殘余病灶等不相關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 SM22α基因mRNA的表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 SM22α蛋白表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 應(yīng)用t檢驗將SM22α蛋白表達(dá)水平與EOC患者各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示淋巴轉(zhuǎn)移陽性患者的癌組織中SM22α蛋白表達(dá)水平顯著低于淋巴轉(zhuǎn)移陰性患者的癌組織(P<0.05)，而其表達(dá)水平與患者年齡、臨床分期、組織學(xué)分級、腫瘤病理學(xué)類型、手術(shù)殘余病灶等不相關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 SM22α蛋白表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中SM22α mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織，且卵巢癌組織中SM22α mRNA及其蛋白表達(dá)水平表達(dá)與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

SM22α通過與細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和表型分化維持方面起重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)SM22α在肺癌[7]、乳腺癌[8]、大腸癌[9]、前列腺癌[11]等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。Thompson等[12]報道了SM22α的表達(dá)缺失可導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生；Zhang等[13]研究表明SM22α表達(dá)升高可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡；Xie等[14]報道了SM22α在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其可通過促進(jìn)細(xì)胞的自噬作用來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。這些研究表明了SM22α可能是一種抑癌基因。但是，也有研究報道稱SM22α在胰腺癌[15]、食管癌[16]及胃癌[17]等癌組織中表達(dá)上調(diào)。因此，需要更加系統(tǒng)、深入的研究來明確SM22α在不同類型腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的功能及作用機(jī)制。

本研究應(yīng)用qRT-PCR及Western blot檢測了卵巢癌組織中SM22α mRNA及蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SM22α在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織，且臨床病理參數(shù)分析顯示卵巢癌組織中SM22α mRNA及其蛋白表達(dá)水平表達(dá)與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，然而SM22α在卵巢癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、分期、分化及殘余病灶等無關(guān)，表明SM22α基因的低表達(dá)可能增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。本研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果相似，Lawson等[10]研究表明SM22α表達(dá)降低可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。因此，我們推測SM22α表達(dá)下調(diào)可能增加了卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，從而參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展。但其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究和明確。

綜上所述，本研究結(jié)果提示卵巢癌組織中SM22α基因mRNA及蛋白表達(dá)低于正常卵巢組織，且其表達(dá)水平與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明SM22α在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，有可能成為卵巢癌分子診斷和治療的重要靶點。