唐月明，伊 潔

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730）

在許多感染性疾病中，病原體的量化已經(jīng)被證明是一項(xiàng)有用的預(yù)后指標(biāo)和監(jiān)測治療反應(yīng)的重要參考。實(shí)時(shí)熒光定量多聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）作為二代核酸檢測方法，已在實(shí)驗(yàn)室被廣泛使用。它通過在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的探針來實(shí)時(shí)檢測熒光信號(hào)，借助熒光曲線的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）和標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量起始靶基因的濃度，為相對(duì)定量技術(shù)。這種方法能有效測定對(duì)數(shù)拷貝數(shù)，動(dòng)態(tài)范圍寬，但由于很多因素都會(huì)影響qPCR 的效率，比如在低拷貝靶分子（如病原體本身含量低或者部分患者在檢測前已使用抗生素治療）、復(fù)雜模板背景（如大量人基因組會(huì)干擾引物和探針的特異度反應(yīng)、qPCR 抑制物存在）、擴(kuò)增效率低下（靶基因具有多態(tài)性卻使用統(tǒng)一的探針及引物）、探針保存不當(dāng)導(dǎo)致部分降解、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線偏斜等情況下，其Ct值都會(huì)受到影響，因此qPCR 的準(zhǔn)確度和精密度可能會(huì)有很大的差異[1]。除此之外，缺乏絕對(duì)定量值來校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致qPCR 結(jié)果不精密度高及各實(shí)驗(yàn)室之間的可比性差。所以qPCR 作為臨床常規(guī)檢測技術(shù)存在不足之處，尤其是在復(fù)雜背景下檢測低含量的靶基因時(shí)，需要更加敏感和穩(wěn)定的方法檢測。數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital PCR，dPCR）作為一種新的準(zhǔn)確定量技術(shù)，在基因的絕對(duì)定量檢測中得到廣泛應(yīng)用，尤其是對(duì)微量樣本的絕對(duì)定量。

現(xiàn)將dPCR 技術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)勢及在病原微生物檢測中的應(yīng)用綜述如下。

1 dPCR 簡介

1999年VOGELSTEIN 等[2]采用96 孔板對(duì)樣本進(jìn)行了微升級(jí)別的PCR 擴(kuò)增，從而提出了dPCR的概念。隨著技術(shù)的進(jìn)步，dPCR 近年來逐漸興起，成為一種新的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，其將微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液，實(shí)現(xiàn)理論上的單分子擴(kuò)增，然后用終點(diǎn)法PCR 和統(tǒng)計(jì)學(xué)中的柏松分布原理計(jì)算出樣品的原始濃度[1]。

dPCR 根據(jù)樣品分散模式不同分為磁珠模式、微滴模式和芯片模式，后兩者更為常見。其中微滴模式是隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)發(fā)展起來的新模式，也叫微滴式dPCR（droplet digital PCR，ddPCR）。它的原理是微滴發(fā)生器將PCR 反應(yīng)混合液通過打散并制成數(shù)萬個(gè)皮升級(jí)大小的油包水液滴后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，每個(gè)微滴中會(huì)含有一個(gè)或者不包含目標(biāo)分子，每個(gè)微滴內(nèi)的PCR 反應(yīng)在相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境里獨(dú)自反應(yīng)，反應(yīng)完成后，通過對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行熒光檢測，含有熒光信號(hào)的微滴確定為陽性，不含熒光信號(hào)的微滴確定為陰性。對(duì)微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以準(zhǔn)確得出含有目標(biāo)分子的微滴數(shù)和不含目標(biāo)分子的微滴數(shù)，同時(shí)可以以一維圖或二維圖呈現(xiàn)檢測結(jié)果。每微升的目標(biāo)數(shù)是使用一個(gè)包含陽性微滴數(shù)、總微滴數(shù)和微滴體積的公式來計(jì)算的[3]。隨著濃度的增加，單個(gè)反應(yīng)體系可能包含2 和/或多個(gè)目標(biāo)模板分子，這時(shí)能夠通過泊松分布進(jìn)行校正，從而計(jì)算出樣品中靶分子濃度，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。芯片模式即芯片PCR（chip dPCR，cdPCR），是由物理隔離的腔室組成，在微孔中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。因此，檢測芯片擴(kuò)增的熒光可以代表陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的數(shù)量。根據(jù)樣品分布方法不同進(jìn)一步分為基于微孔的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)樣品分散模式、基于通道的樣品分散模式、基于水凝膠珠的樣品分散模式和基于噴墨的樣品分散模式[4]。

2 dPCR 技術(shù)的優(yōu)勢

2.1 更高的敏感度和精密度 因?yàn)閐PCR 將樣本分成若干小PCR 反應(yīng)分區(qū)，可實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)檢測，避免了模板間的競爭效應(yīng)，理論上可以提高低豐度目的序列的檢測敏感度，也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5]，dPCR 在測量某些病原體時(shí)具有更高的敏感度。由于dPCR較少受到擴(kuò)增效率的影響，并且采用終點(diǎn)法定量，因此具有更高的精密度和準(zhǔn)確性[3,6-7]。

2.2 更高的重復(fù)性和通用性 dPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)品，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，也不依賴熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，直接計(jì)算樣品中目的核酸分子的個(gè)數(shù)，可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，重復(fù)性和通用性高[8]，因此dPCR 可用于給常規(guī)qPCR 所需的標(biāo)準(zhǔn)品定量，具有計(jì)量學(xué)意義[6]。

2.3 更高的抗干擾能力和穩(wěn)定性 QUAN 等[9]系統(tǒng)比較了十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA）及肝素等常見PCR 抑制物對(duì)ddPCR 和qPCR 的影響，結(jié)果顯示，ddPCR對(duì)SDS 和肝素的耐受程度高于qPCR，但是抗EDTA 的表現(xiàn)并不突出。NIXON 等[10]人也發(fā)現(xiàn)cdPCR 對(duì)乙醇和血漿抑制作用的敏感性較低，但是對(duì)EDTA 依舊敏感。dPCR 耐受能力高的可能原因包括：在ddPCR 中，樣品被分割成許多微小的反應(yīng)區(qū)，這提高對(duì)緩蝕劑的抵抗力[7]；用于生成液滴乳液的油可能將一些抑制物質(zhì)從水相PCR 反應(yīng)中分離出來；qPCR 是依賴每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)來進(jìn)行定量，dPCR 是終點(diǎn)法而不是實(shí)時(shí)擴(kuò)增進(jìn)行定量，因此較少收到樣本中可能存在的抑制物的影響[1]，可以應(yīng)用在復(fù)雜臨床樣本（血液、糞便和組織等）中的病原微生物或其他標(biāo)志物的檢測[11]，通用性更高。

3 dPCR 技術(shù)的應(yīng)用

3.1 低載量病原微生物的DNA 檢測 優(yōu)越的精密度和敏感度使dPCR 可用于低載量致病微生物的早期檢測及治療的后續(xù)監(jiān)測，提供客觀和量化的判斷閾值。USHIO 等[12]利用dPCR 成功地在肺結(jié)核患者的血漿樣本中檢測到結(jié)核桿菌DNA，并提出這種微創(chuàng)、快速和準(zhǔn)確的循環(huán)檢測結(jié)核桿菌 DNA 的方法有可能成為一種新的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，輔助結(jié)核早期確診。關(guān)于dPCR 檢測人乳頭瘤病毒（human papillomavirus,HPV）相關(guān)癌癥患者血清中HPV DNA 的研究表明，可以使用這種高靈敏度的技術(shù)進(jìn)行亞臨床腫瘤腫塊的生物學(xué)檢測,例如早期浸潤癌、微小殘留或早期復(fù)發(fā)的腫瘤監(jiān)測[13]。STRAIN 等[9]論證并提出dPCR 的高敏感度和精密度有助于測量潛伏中的HIV 病毒進(jìn)而能夠及時(shí)干預(yù)，達(dá)到早期消除的目的。2013年，PERSAUD 等[14]對(duì)1 例感染HIV 的嬰兒從出生后30 h 至18 個(gè)月時(shí)期進(jìn)行聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療，在停止治療后，分別在嬰兒24個(gè)月和26 個(gè)月的時(shí)候，使用ddPCR 檢測嬰兒血液中HIV DNA 水平，檢測發(fā)現(xiàn)嬰兒體內(nèi)細(xì)胞相關(guān)的HIV-1 DNA 幾乎完全消失，殘存片段不具備復(fù)制能力。2020年，英國學(xué)者[15]用ddPCR 等核酸檢測方法對(duì)接受了異基因干細(xì)胞移植，并且中斷分析治療18 個(gè)月的病人進(jìn)行了HIV-DNA 的檢測，ddPCR 被用來檢測腸道活檢和淋巴結(jié)組織的細(xì)胞。結(jié)果顯示，該病人在各基質(zhì)中均沒有檢測到具有復(fù)制能力的病毒，因此認(rèn)為這些發(fā)現(xiàn)代表了HIV 患者的治愈。可見，dPCR 優(yōu)越的檢測能力在HIV 治療后監(jiān)測中起到了關(guān)鍵作用。

關(guān)于人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,CMV）的研究發(fā)現(xiàn)，CMV 病毒載量從200 copies/ml以下增長到200 copies/ml 以上時(shí)患者會(huì)出現(xiàn)明顯的癥狀[16]，能夠檢測CMV 載量的微小變化在臨床上具有明顯的意義，因此dPCR 在CMV 的研究領(lǐng)域中被廣泛使用。QUAN 等[9]發(fā)現(xiàn)qPCR 比ddPCR有更高的敏感度，但是該研究中qPCR 和ddPCR 的初始DNA 模板量不等，因此可能導(dǎo)致ddPCR 敏感度下降。在優(yōu)化試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，ddPCR 在敏感度相同的情況下，批間精密度和批內(nèi)精密度都更高，這種優(yōu)勢有利于體內(nèi)CMV 的持續(xù)檢測[17]。在其他基質(zhì)中，也有研究者用dPCR 對(duì)CMV 進(jìn)行絕對(duì)定量：CAO 等[5]用dPCR 技術(shù)對(duì)60 例青光眼睫狀體炎綜合征患者的房水進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)27 例CMV 陽性，而qPCR 法僅發(fā)現(xiàn)20 例陽性，二代測序驗(yàn)證結(jié)果與dPCR 檢測結(jié)果完全一致，其證明dPCR 的高敏感度更適合用于房水樣本中微量病毒的檢測，可以避免重復(fù)的有創(chuàng)操作。dPCR 是近年來在寄生蟲學(xué)中應(yīng)用的一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù)，在惡性瘧原蟲和日本血吸蟲中顯示出明顯優(yōu)于qPCR 的優(yōu)勢，在無癥狀和低密度感染中，dPCR 可能成為檢測寄生蟲血癥的首選方法[18]。

理想的精密度使得dPCR 可用于測量高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)目標(biāo)基因的擴(kuò)增比率。人類皰疹病毒6型（human herpesvirus 6，HHV-6）能夠潛伏感染大多數(shù)成人。在大約1% 的人群中，HHV-6 能夠整合在人類染色體上（chromosomally integrated human herpesvirus 6，ciHHV-6），并通過生殖系統(tǒng)傳播。在檢測活動(dòng)性HHV-6 感染時(shí)，遺傳了ciHHV-6 的患者經(jīng)常被誤診產(chǎn)生不必要的治療和副作用。SEDLAK 等[19]運(yùn)用dPCR 通過精確測定HHV-6 和人DNA 的比率來快速準(zhǔn)確地鑒定ciHHV-6 的方法。遺傳了ciHHV-6 的個(gè)體HHV -6/人細(xì)胞比例為1:1。在造血細(xì)胞移植的背景下對(duì)這些人進(jìn)行識(shí)別有助于解釋HHV-6 檢測的陽性結(jié)果，并可能避免使用抗病毒藥物進(jìn)行不必要的治療。該團(tuán)隊(duì)還在隨后的研究中建立了新的dPCR 方法能夠識(shí)別是哪一種亞類-HHV-6A 或者HHV-6B。

3.2 低載量病原微生物的RNA 檢測 dPCR 也被用于RNA 的定量檢測。乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV) RNA 是一種反映共價(jià)封閉環(huán)狀DNA活性的新標(biāo)記。然而，檢測HBV RNA 的方法一直是一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)。LIMOTHAI 等[20]人比較了逆轉(zhuǎn)錄ddPCR（reverse transcriptase droplet digital PCR,RT-ddPCR）和逆轉(zhuǎn)錄qPCR（reverse transcriptase quantitative real-time PCR,RT-qPCR）對(duì)不同治療階段的慢性乙肝患者血清的HBV RNA 檢測，結(jié)果顯示RT-ddPCR 在所有濃度的 RNA 定量一致性方面均優(yōu)于RT-qPCR，可以提高血清RNA 的檢測敏感度，成為HBV RNA 定量的最佳方法。dPCR 也被用于檢測細(xì)菌核糖體RNA，結(jié)合測序技術(shù)，對(duì)危重病人肺微生物群進(jìn)行定量和表征，輔助分析危重病人預(yù)后與入院時(shí)肺微生物群特征的關(guān)系[21]。在2020年造成全國緊急公共衛(wèi)生事件的新型冠狀病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，Sars-Cov-2）的檢測中，ddPCR 展現(xiàn)出其在低載量病毒檢測中的優(yōu)越性。LIU 等[22]人建立了ddPCR的臨界值，為40 copies/ml，顯著低于目前常用qPCR 的檢測下限（1 000,500 copies/ml 等）。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明，ddPCR 對(duì)確診病人的拭子檢出陽性率高于qPCR[23]，在qPCR 陰性的出院患者樣本中仍檢測出了Sars-Cov-2 的存在[22,24]，表明ddPCR 有助于減少假陰性結(jié)果的發(fā)生，降低了病毒傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，ddPCR 可以報(bào)告病毒載量的具體數(shù)值，可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者的SARS-CoV-2 病毒載量，利于病毒載量與預(yù)后關(guān)系的研究。

3.3 基因多態(tài)性的檢測 dPCR 不僅可以對(duì)低載量病毒絕對(duì)定量，還可在200 000 個(gè)野生型病毒中定性檢測出變異病毒，檢測限達(dá)0.005%，而qPCR 和焦磷酸測序法只能檢測高于10%的突變基因[25]。由于基因組的高度多樣性，引物或探針的不匹配可能會(huì)降低擴(kuò)增或探針?biāo)獾男?，在這種情況下，qPCR 可能大大低估了真實(shí)的模板拷貝數(shù)，利用病原體DNA 序列數(shù)據(jù)定制患者特異性引物和探針可以解決此問題，但是該方法繁瑣，可行性差。dPCR 由于不依賴于擴(kuò)增效率，而擴(kuò)增效率會(huì)受到引物或探針結(jié)合區(qū)序列失配的影響，因此，dPCR比qPCR 具有更高的準(zhǔn)確性，可用于基因組多態(tài)性的突變檢測，包括稀有突變、單堿基突變及拷貝數(shù)的變異。已報(bào)道的利用dPCR 技術(shù)定性檢測序列多樣性高的病原體包括結(jié)核桿菌[12]、BK 病毒（BK virus,BKV）[26]、JC 病毒（JC virus,JCV）[27]等。在此基礎(chǔ)上利用dPCR 檢測變異的耐藥菌株，對(duì)用藥的療程管理和療效預(yù)測有十分重要的意義。利用dPCR 已能成功區(qū)分對(duì)甲氧西林耐受或者敏感的金黃色葡萄球菌[28]。ABRAM 等[29]人證明dPCR 技術(shù)可以直接從全血中識(shí)別攜帶特定耐藥基因的病原體并且具有100% 的敏感度和特異度。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)品絕對(duì)定量值的建立 美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所采用dPCR 對(duì)CMV 進(jìn)行了絕對(duì)拷貝數(shù)的測量，這也是第一次采用dPCR 建立標(biāo)準(zhǔn),并根據(jù)精確確定的已知擴(kuò)增DNA 分子數(shù)來進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室的方法校準(zhǔn)驗(yàn)證和質(zhì)量控制[30]。此后dPCR 陸續(xù)被用于CMV 的qPCR 標(biāo)準(zhǔn)品的定值[31]。dPCR 在對(duì)WHO 國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拷貝數(shù)異質(zhì)性鑒定中也起到了一定作用。例如，由于T 抗原等區(qū)域的大范圍不同缺失，導(dǎo)致多瘤病毒基因組不同位點(diǎn)之間拷貝數(shù)顯著差異，會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果顯著不同，利用dPCR對(duì)WHO 關(guān)于BKV 和JCV 的國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)定量結(jié)果可相差8 倍，這一發(fā)現(xiàn)經(jīng)下一代測序證實(shí)是由于該國際標(biāo)準(zhǔn)中存在多個(gè)病毒亞群[26-27]。

3.5 不同基質(zhì)中病原微生物的檢測 dPCR 具有比qPCR 更高的抗干擾能力和穩(wěn)定性，對(duì)不同基質(zhì)的抑制作用更強(qiáng)，在糞便組織檢測幽門螺桿菌[32]、石蠟包埋組織檢測HBV[11]中表現(xiàn)出優(yōu)越的靈敏度和特異度，在鼻咽拭子、痰液、尿液、精液等其他基質(zhì)中也有應(yīng)用[5,23,33-34]，便于研究者對(duì)致病微生物進(jìn)行研究，能夠幫助病人獲得早期診斷。

3.6 其他新興應(yīng)用

3.6.1 多重dPCR 檢測:ddPCR 實(shí)現(xiàn)了CMV，人腺病毒（human adenovirus,ADV）的多重DNA 檢測，并對(duì)糞便中兩種病毒進(jìn)行了分析，靈敏度均高于同時(shí)進(jìn)行檢測的qPCR，保證了易受抑制的臨床標(biāo)本的準(zhǔn)確測定，防止了假陰性[11]。

3.6.2 為高通量測序技術(shù)提供靈敏校準(zhǔn):DING 等[35]使用dPCR 精確定量測序模板，使測序文庫在沒有預(yù)擴(kuò)增的前提下對(duì)樣品需求體積減少了1 000 倍以上至皮克級(jí)，同時(shí)消除了構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線帶來的不確定性，最大限度的減少了偏倚，成功地對(duì)低于納克級(jí)的細(xì)菌和哺乳動(dòng)物的DNA 樣品進(jìn)行了測序。EASTBURN 等[36]人引入了微流控液滴富集技術(shù)，將5 個(gè)不同基因組位點(diǎn)的靶基因富集了31.6 倍，應(yīng)用dPCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了測序文庫的絕對(duì)定量，且大大降低了樣本用量、測序成本和時(shí)間。將下一代測序方法與dPCR 聯(lián)合使用可被視為未來病毒學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的發(fā)展趨勢,能夠更全面識(shí)別目標(biāo)基因座內(nèi)的遺傳多態(tài)性。

3.6.3 免除核酸提取，減少工作流程:PAVSIC等[31]分別用兩個(gè)不同的dPCR 平臺(tái)（Bio-Rad 和Biomark）分別對(duì)病毒DNA 進(jìn)行免提取及提取后dPCR 定量分析，結(jié)果表明兩種平臺(tái)的免提取方法測得濃度與實(shí)際病毒載量更接近。這是第一份免DNA 提取進(jìn)行dPCR 直接定量的研究。免DNA 提取進(jìn)行病原微生物定量將大大減少工作流程，提高工作效率，節(jié)省臨床周轉(zhuǎn)時(shí)間，但是仍然需要對(duì)其他病毒、參考物質(zhì)和臨床相關(guān)基質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，ddPCR 也被用于直接從全血樣本中進(jìn)行細(xì)菌鑒定和抗生素敏感性分析，為血液感染和抗生素耐藥早期指導(dǎo)和適當(dāng)治療提供快速診斷[29]。

3.6.4 與多種擴(kuò)增技術(shù)整合:將數(shù)字技術(shù)同其他擴(kuò)增技術(shù)整合的模式比如數(shù)字環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（digital loop-mediated isothermal amplification,dLAMP）和數(shù)字重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（digital recombinase polymerase amplification,dRPA） 也有報(bào)道。dLAMP 易于組裝和操作的特點(diǎn)，可以在沒有預(yù)處理設(shè)備、輔助儀器或控制系統(tǒng)的情況下形成堅(jiān)固的液滴。研究者利用dLAMP 定量HPV[37]，發(fā)現(xiàn)雖然敏感度低于dPCR，但其定量性能及抗抑制劑性能均優(yōu)于qLAMP，后者無法對(duì)1 000 copies/ml以下的核酸進(jìn)行定量[10]。而GORGANNEZHAD 等[38]人描述的一種微流控dRPA SlipChip 是利用RPA替代dPCR 所需要的溫度循環(huán)，通過在每個(gè)反應(yīng)室中添加一個(gè)化學(xué)引發(fā)劑，只需簡單的滑動(dòng)步驟，即可同時(shí)引發(fā)1 000 多個(gè)納升規(guī)模的RPA 反應(yīng)。經(jīng)過驗(yàn)證，該模式與相同SlipChip 基礎(chǔ)上的dPCR 性能相當(dāng)。

4 小結(jié)與展望

dPCR 雖具有更高的敏感度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，也已在相應(yīng)領(lǐng)域獲得了應(yīng)用，但是該技術(shù)在未來能否廣泛應(yīng)用仍具有許多挑戰(zhàn)。

4.1 通量低 qPCR 可同時(shí)檢測96 個(gè)樣本甚至更多，但是cdPCR 的每張芯片上最多分析48 個(gè)樣品，ddPCR 則更少，因此應(yīng)增加檢測通量，以降低臨床周轉(zhuǎn)時(shí)間。

4.2 靈敏度需提高 增加單樣本反應(yīng)分區(qū)數(shù)和熒光通道數(shù)量或改進(jìn)熒光編碼的方法，可以進(jìn)一步提升檢測靈敏度甚至同時(shí)檢測多種靶標(biāo)。

4.3 檢測范圍受限 由于dPCR 需要單分子級(jí)檢測，在不同濃度下需要不同的稀釋方法，尤其是高濃度下增加稀釋分區(qū)以確保儀器不飽和。

4.4 RNA 定量易受影響 雖然dPCR 被廣為應(yīng)用于核酸的檢測，其在RNA 定量檢測領(lǐng)域仍是需要不斷發(fā)展的，目前看仍然是依賴于轉(zhuǎn)錄效率和檢測效率的。在進(jìn)行RNA 定量時(shí)，由于逆轉(zhuǎn)錄酶和引物等因素影響，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄過程不完整，使得cDNA 與原始RNA 拷貝數(shù)目不一致；或者由于分子丟失效應(yīng)，比如在反應(yīng)孔中同時(shí)添加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和cDNA 擴(kuò)增體系，擴(kuò)增體系受到抑制，導(dǎo)致不是所有模板都被擴(kuò)增，因此對(duì)RNA 定量不準(zhǔn)確。

4.5 價(jià)格昂貴 dPCR 未來應(yīng)降低成本以解決因?qū)嶒?yàn)成本昂貴而無法普及的現(xiàn)狀。

4.6 不同廠家間結(jié)果互通性仍需提高 雖然dPCR是絕對(duì)定量，但是不同廠家使用的不同試劑和平臺(tái)檢測結(jié)果仍然不一致，已有研究者采用三套PCR試劑和兩個(gè)dPCR 平臺(tái)進(jìn)行CMV DNA 的檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在差異[39]，對(duì)檢測到的假陽性信號(hào)，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，雖然dPCR 技術(shù)在達(dá)到普遍應(yīng)用的道路上仍然存在許多不足與挑戰(zhàn)，但是其不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，以絕對(duì)定量的優(yōu)勢，對(duì)低拷貝核酸，尤其是缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的病原體的檢測和定量提供了一種新的發(fā)展方向，dPCR 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展也會(huì)更利于病原體的診斷、治療及耐藥分析監(jiān)測等。但其檢測結(jié)果特別是極低檢測下限在臨床中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步通過更多的研究證明。