吳 鵬 李 莎 時孝晴 廖太陽 陳巨鵬

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇南京 210029

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)受到損壞，脆性增加的全身性疾病[1]。目前，西醫(yī)對OP 的治療主要以促進骨形成和抑制骨吸收為主，大多藥物治療較為局限，具有一定副作用，而且價格較為昂貴[2]。中醫(yī)藥治療OP 效果確切、患者依從性較好，在OP 的治療中占據(jù)十分重要的位置[3]。杜仲-淫羊藿-骨碎補（eucommia ulmoides-epimediumrhizoma drynariae，DYG）一直都是中醫(yī)藥治療OP 的核心藥物，也是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)典名方—補腎活血健骨方的主要組成成分[4-5]，但其治療OP 的主要成分及作用機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠通過分析“藥物-基因-蛋白”的相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地揭示藥物與疾病的相關(guān)性[6-7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，探討DYG 治療OP 的潛在機制，為其治療OP 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選DYG 活性成分與作用靶點

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）獲取杜仲、淫羊藿、骨碎補的活性成分，根據(jù)成分藥物代謝動力學(xué)吸收、分布、代謝、排泄參數(shù)進行篩選，條件設(shè)置如下：藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，聯(lián)合Perl 語言與Uniprot 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org/uniprot/）篩 選出DYG 的相關(guān)靶點[8]。

1.2 OP 靶點查詢與篩選

以“Osteoporosis”為關(guān)鍵 詞 在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索與OP 相關(guān)的基因。將藥物活性成分與疾病相關(guān)的靶點進行映射，篩選出共同靶點，繪制維恩圖。

1.3 構(gòu)建DYG 與OP 作用靶點網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的DYG 活性成分和OP 相關(guān)靶點篩選結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建DYG 活性成分與OP靶點網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 軟件NetworkAnalyzer 工具計算網(wǎng)絡(luò)相關(guān)屬性。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein protein interaction，PPI）及篩選核心靶點

將藥物-疾病共同靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），設(shè)置物種：Homo sapiens，置信度：0.4，保存PPI 圖。將PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，借助CytoNCA 插件，根據(jù)度中心性（degree centrality，DC）、介數(shù)中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心度（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity，LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）等參數(shù)進行拓撲分析。將上述參數(shù)的拓撲分析結(jié)果取兩次中間值，最終獲得的節(jié)點為核心靶點。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析

GO 功能富集分析用來對DYG 治療OP 的分子功 能（molecular function，MF）、生物 過 程（biological process，BP）和細 胞成 分（cellular components，CC）進行注釋。KEGG 信號通路分析用來預(yù)測DYG 治療OP的相關(guān)通路，選擇富集程度最高的前20 項。

1.6 分子對接

使用Discovery Studio 2016 進行分子對接。DYG類藥成分與OP 作用靶點分別通過Chemical Book 數(shù)據(jù)庫和PCSB PDB 數(shù)據(jù)庫獲取。將上述獲得的靶蛋白進行去水、加氫等處理，保存為對接受體。使用Lib-Dock 模塊進行分子對接。LibDock score 評價活性成分和關(guān)鍵靶點之間的對接效應(yīng)，分數(shù)越高提示配體與受體蛋白結(jié)合性越好。

2 結(jié)果

2.1 DYG 活性成分

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置OB 和DL 等參數(shù)初步篩選到生物活性成分75 個，刪除重復(fù)及無效活性成分，最終得到38 個有效活性成分。

2.2 構(gòu)建DYG 活性成分與OP 作用靶點

檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫中成分靶點，刪除無效與重復(fù)的靶點，最終得到168 個活性成分作用靶標(biāo)，在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets 和Drug Bank 數(shù)據(jù)庫中檢索到4547 個與OP 相關(guān)靶點，映射后得到121 個共同靶基因。見圖1。

圖1 DYG 成分與OP 靶點維恩圖

2.3 構(gòu)建DYG 活性成分與OP 靶點網(wǎng)絡(luò)

將38 種活性成分與121 個OP 相關(guān)作用靶點進行映射后導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建DYG 成分-OP 靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。使用NetworkAnalyzer 工具對網(wǎng)絡(luò)圖進行統(tǒng)計，得出各節(jié)點的degree 值。結(jié)果顯示，活性成分中kaempferol（degree=124）的連接度靠前。

圖2 DYG 成分OP 靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點篩選

將121 個關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示其中162 個節(jié)點，638 條邊，見圖3。將TSV 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，基于DC、BC、CC、EC、LAC、NC，使用CytoNCA 對上述數(shù)據(jù)進行分析。最終得到IL-1β、MMP9、MAPK8、CXCL8、VEGFA、PTGS2、JUN、IL-6、MAPK1、EGF、AKT1 為核心靶點，見圖4。

圖3 DYG 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 DYG 治療OP 潛在核心靶點

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

GO 富集分析顯示生物過程主要涉及磷酸酶結(jié)合、酰胺結(jié)合、核受體活動等，見圖5。KEGG 通路分析顯示潛在信號通路主要包括AGE-RAGE、細胞凋亡、IL-17、TNF 等信號通路，見圖6。

圖5 DYG 活性成分潛在治療OP 靶點的GO 功能分析

2.6 分子對接分析

本研究對核心靶點與所有活性成分都進行了分子對接，由于kaempferol 的degree 值最高，所以進行了代表性展示。結(jié)果顯示DYG 活性成分kaempferol與IL -6、EGF、JUN、MAPK8、CXCL8、MMP9、MAPK1、IL-1β 均能較好對接。對接過程見圖7，配對結(jié)果見表1。

表1 kaempferol 與OP 靶受體蛋白分子對接情況

圖7 DYG 活性成分kaempferol 和OP 核心靶點對接過程

3 討論

OP 屬于中醫(yī)“骨痿”“骨枯”范疇。《素問·痿論篇》中：“腎主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。”《諸病源候論·卷三·虛勞病諸候》記載：“肝主筋而藏血，腎主骨而生髓。虛勞損血耗髓，故傷筋骨也?！北砻鞔蠖噌t(yī)家認為OP 的發(fā)生多與脾腎虧虛、肝郁氣滯血瘀密切相關(guān)，“虛”為本，瘀為“標(biāo)”[9-10]。

杜仲、淫羊藿和骨碎補已被廣泛運用于OP 的治療。馬定耀等[11]研究結(jié)果顯示，骨碎補、淫羊藿配伍杜仲能顯著提高OP 患者的骨密度，緩解疼痛。賴滿香等[12]基于中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)對治療原發(fā)性O(shè)P 的相關(guān)方劑組方規(guī)律進行了相關(guān)分析，結(jié)果顯示淫羊藿、杜仲、補骨脂組合在相關(guān)治療OP 的方劑中使用達16 次，杜仲、淫羊藿和骨碎補在相關(guān)處方中使用頻數(shù)分別達到52、46、41 次。趙亮等[13]研究結(jié)果顯示，給予去卵巢OP 大鼠6 g/kg 鹽灸杜仲能夠促進成骨細胞分化，抑制骨吸收。朱貴忱等[14]發(fā)現(xiàn)淫羊藿聯(lián)合鈣爾奇D 較單獨口服鈣爾奇D 更能顯著縮短OP 患者腰背部疼痛時間，增加骨密度。李展春等[15]發(fā)現(xiàn)骨碎補能夠改善OP 大鼠骨微結(jié)構(gòu)，提高生物力學(xué)性能。

本研究篩選出了DYG 的38 個活性成分，其中骨碎補的有效成分柚皮素能夠上調(diào)Bcl-2 表達、下調(diào)Bax、Caspase-3 表達抑制成骨細胞凋亡[16]。骨碎補總黃酮能夠促進大鼠成骨細胞內(nèi)VEGF 和成纖維細胞生長因子2（FGF-2）的表達，促進血管新生，有助于成骨細胞的增殖和分化[17]。淫羊藿苷能夠激活成骨細胞內(nèi)cAMP-PKA 信號通路，顯著增加堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原和Runx-2 的表達促進成骨細胞的增殖[18-19]。杜仲總苷能顯著提升去睪丸大鼠骨密度和ALP 的濃度[20]。杜仲乙醇提取物能夠促進成骨細胞增殖，間接抑制破骨細胞分化[21]。在11 個防治OP 的作用靶點中有8 個相關(guān)蛋白最終成功分子對接。IL-1β 能夠調(diào)節(jié)骨重吸收，刺激成骨細胞產(chǎn)生IL-6 和TNF，相互協(xié)調(diào)共同促進骨吸收。IL-6 能夠誘導(dǎo)破骨細胞活化，增加活性，抑制凋亡，延長壽命。EGF 可以作用于骨吸收和骨形成，能夠激活破骨細胞，抑制其相關(guān)功能[22]。MMP9 與破骨細胞分解骨基質(zhì)有機成分能力密切相關(guān)，是破骨細胞骨吸收的重要標(biāo)志物[23]。MAPK8 能夠調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和存亡。MAPK1 可以通過促進成骨細胞的增殖，增加成骨能力。CXCL8 和JNK 均能加劇炎癥反應(yīng)[24-26]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接對DYG 治療OP 的作用機制進行了相關(guān)分析，通過GO 功能富集分析和KEGG 通路分析，初步推測DYG 可能通過相關(guān)有效活性成分調(diào)控IL-6、EGF、JUN、MAPK8、CXCL8、MMP9、MAPK1、IL-1β 等靶點調(diào)節(jié)AGE-RAGE、細胞凋亡、IL-17、TNF 等信號通路，抑制破骨細胞的生成，刺激成骨細胞生長，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，抑制相關(guān)炎癥因子。本研究初步闡釋了DYG 多靶點，多通路治療OP，為DYG 治療OP 提供了科學(xué)依據(jù)和新的方向。