傅傳經(jīng)，高覺民，李 翔，吳鶴鳴

(1.江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南京 210029;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南京 210006)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)多是由于顱內(nèi)血管壁破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起一系列癥狀的疾病，具有較高的致殘率和致死率，而動(dòng)脈瘤破裂是其最常見的病因[1]。SAH后早期腦損傷是指SAH后72 h內(nèi)的繼發(fā)性損傷，以繼發(fā)性細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)為主要特征，其病理生理機(jī)制十分復(fù)雜；炎癥反應(yīng)是早期腦損傷發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，也是SAH患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的最重要原因之一[2-3]。因此，減輕SAH后的炎癥反應(yīng)，從而減少繼發(fā)性細(xì)胞凋亡是預(yù)防早期腦損傷的重點(diǎn)，同時(shí)也是近年來研究的熱點(diǎn)。以往關(guān)于SAH后炎癥反應(yīng)及早期腦損傷的研究多集中于化學(xué)合成藥物，而中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，隨著中藥分離純化技術(shù)的發(fā)展，中藥單體近年來逐漸成為了神經(jīng)保護(hù)劑相關(guān)研究的熱點(diǎn)。青藤堿(sinomenine，SIN)是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿，可有效抑制多種炎癥因子的活性，從而減輕各種原因?qū)е碌慕M織器官炎性損傷[4]，還可明顯減輕創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但目前國內(nèi)外尚無SIN對SAH后炎癥反應(yīng)及早期腦損傷的影響及相關(guān)機(jī)制的研究。本研究擬建立大鼠SAH模型，探討SIN對SAH后炎癥反應(yīng)及早期腦損傷的影響，為臨床SAH的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

青藤堿注射液(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z43020279，規(guī)格：50 mg/2 mL)、β-actin一抗(Bioworld生物技術(shù)公司，批號：AP0060)、戊巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司，批號：20181222)、4%多聚甲醛固定液(上海歌凡生物科技有限公司，批號：G1101)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物有限公司，批號：P0012AC)、蛋白質(zhì)提取試劑盒(南京翼飛雪生物科技有限公司，批號：YWB001)、山羊二抗(Bioworld生物技術(shù)公司，批號：BS12478)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及SAH模型建立

選用SPF級成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量280～310 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0049]，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為Sham組、SAH組和SAH+SIN組，每組12只。所有大鼠均在實(shí)驗(yàn)前7 d放入實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，在光照和黑暗各12 h環(huán)境下自由進(jìn)食和飲水。所有大鼠均使用2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后仰臥于操作臺，經(jīng)大鼠股動(dòng)脈抽取自體血0.3 mL。SAH組和SAH+SIN組大鼠止血后，將大鼠俯臥固定于操作臺，頭頸部備皮并碘伏消毒、鋪巾。在大鼠左右耳根連線中點(diǎn)摸到枕外隆凸，以其下大約0.5 cm處為穿刺點(diǎn)，沿中線在頸部皮膚作1個(gè)長約1.5 cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織，找到枕骨大孔后經(jīng)環(huán)枕膜穿刺，回抽見腦脊液后將自體血以0.1 mL/min注入枕大池，同時(shí)注意觀察大鼠生命體征變化，注射完畢后以止血紗封閉穿刺口，并逐層縫合切口。注血時(shí)使大鼠保持頭低位30 min，間隔48 h再次注血，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均于造模后返回原籠子中。Sham組大鼠僅切開頭皮；SAH組大鼠枕大池注血造模；SAH+SIN組大鼠造模30 min后給予腹腔注射SIN 50 mg/kg。大鼠造模后24 h，用2%戊巴比妥鈉麻醉并仰臥位固定，打開胸腔及心包，迅速剪開右心耳，并經(jīng)左心室灌注4 ℃生理鹽水，待肝發(fā)白后迅速斷頭取腦，若腦基底池蛛網(wǎng)膜下腔布滿血液表示造模成功。

1.3 神經(jīng)功能評分

造模后24 h，采用改良Garcia評分評價(jià)所有大鼠的神經(jīng)功能，包括自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對稱性、前肢伸展、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、身體觸覺和胡須觸覺反射等項(xiàng)目，每項(xiàng)評分0～3分，得分范圍0～18分，得分越低表明神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.4 標(biāo)本制備

大鼠(每組6只)斷頭取傷灶周圍腦組織并置于試管中，按照蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物有限公司，P0027)說明書提取總蛋白，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液并勻漿，于4 ℃以12 000 r/min的速度離心15 min，取上清液為總蛋白，加入5×Lodding buffer并加熱5 min使蛋白變性，隨后于-70 ℃低溫保存。用于TUNEL染色的大鼠(每組6只)麻醉后心臟灌注PBS和4%多聚甲醛，取腦組織制作冰凍切片。

1.5 腦水腫檢測

神經(jīng)功能評分測定完成后，將大鼠(每組6只)斷頭處死取腦組織，濾紙吸干后用電子天平稱量濕重，然后置于100 ℃烘箱中烘烤72 h至腦組織的重量不再變化(2次稱重誤差<0.2 mg)，記為干重，然后計(jì)算腦組織水含量，腦組織水含量=[(濕重-干重)]/濕重×100%。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒壓110 V電泳至蛋白完全分離后，250 mA目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PDFA膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后加入β-actin(1∶2 000)、NLRP3(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)及TNF-α(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗3次，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，TBST漂洗3次，以ECL發(fā)光液(Millipore)顯影后用自動(dòng)曝光儀(Fuji Hyperfilm,日本)曝光。用UN-SCAN-IT軟件(Silk Scientific Inc,美國)分析灰度值。

1.7 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡

取冰凍切片,復(fù)溫后冷丙酮固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min,山羊血清封閉1 h，加入NeuN一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；加入二抗(1∶200)，室溫孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；切片晾干后加入DAB顯色液；光鏡下確定染色滿意后，蒸餾水沖洗，Harris蘇木素染色3 min，用濃度大于1%的酒精浸潤，再用蒸餾水沖洗，浸入氨水中，蒸餾水再次沖洗，晾干后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評分與腦水腫

與Sham組相比,SAH組及SAH+SIN組神經(jīng)功能評分明顯降低，腦組織水含量明顯增加(P<0.05)；與SAH組相比，SAH+SIN組神經(jīng)功能評分明顯升高，腦組織水含量明顯降低(P<0.05)，見圖1。

a：大鼠神經(jīng)功能評分；b：大鼠腦組織水含量 *：與Sham組相比，P<0.05；△：與Sham組相比，P<0.001；#：與SAH組相比，P<0.05

2.2 大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡

與Sham組相比，SAH組及SAH+SIN組凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯增加(P<0.05)；與SAH組相比，SAH+SIN組凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，見圖2。

黑色箭頭：陽性細(xì)胞；*：與Sham組相比，P<0.01；△：與Sham組相比，P<0.001；#：與SAH組相比，P<0.05

2.3 大鼠NLRP3、IL-1β及TNF-α表達(dá)

與Sham組相比，SAH組及SAH+SIN組NLRP3、IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，SAH+SIN組NLRP3、IL-1β及TNF-α表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖3。

a:Western blot檢測蛋白表達(dá)；b:TNF-α蛋白相對表達(dá)量；c:IL-1β蛋白相對表達(dá)量；d:NLRP3蛋白相對表達(dá)量 *：與Sham組相比，P<0.05；△：與Sham組相比，P<0.01；▲：與Sham組相比，P<0.001；#：與SAH組相比，P<0.05

3 討論

SAH后早期腦損傷主要是由于血液短時(shí)間內(nèi)大量進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)致顱內(nèi)壓急劇升高，腦灌注壓隨之降低，從而引起腦細(xì)胞急性缺血缺氧；同時(shí)，紅細(xì)胞分解釋放出血紅蛋白、含鐵血黃素等大量生物活性物質(zhì)，激活了SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程[5]。大量研究證明，SAH后早期腦損傷是SAH預(yù)后不良的重要因素，也是SAH致殘、致死的主要原因[6-7]。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，SAH組大鼠腦組織水含量較高，表明腦水腫明顯，SAH后大鼠腦細(xì)胞處于缺血、缺氧狀態(tài)，且顱內(nèi)壓增高；SAH組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低，表明SAH后大鼠發(fā)生了神經(jīng)功能缺失；SAH組大鼠凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯增加，表明SAH導(dǎo)致了明顯的早期腦損傷。因此，SAH后對早期腦損傷進(jìn)行干預(yù)，在預(yù)防SAH后神經(jīng)功能障礙方面有重大意義，但目前臨床尚無公認(rèn)的有效處理措施。

SAH后紅細(xì)胞降解產(chǎn)物也可誘導(dǎo)多種炎癥因子分泌，并激活下游級聯(lián)放大反應(yīng)介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致早期腦損傷[8]。因此，神經(jīng)炎癥與SAH后早期腦損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。炎性小體NLRP3及其下游IL-1β、IL-18等因子的激活可導(dǎo)致更多炎癥細(xì)胞的聚集，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致血管細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡。而SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活，血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)增加，釋放IL-1β、TNF-α等炎癥因子，導(dǎo)致早期腦損傷[9-10]。TNF-α是多種神經(jīng)元及神經(jīng)周圍細(xì)胞受刺激時(shí)分泌的一種促炎因子，可在突觸水平誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，并可通過突觸神經(jīng)元細(xì)胞膜上的TNF受體調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[11]。因此，本研究選擇檢測NLRP3、IL-1β和TNF-α等炎癥反應(yīng)指標(biāo)，結(jié)果顯示，SAH組NLRP3、IL-1β及TNF-α表達(dá)較Sham組明顯增加，表明炎癥反應(yīng)被激活。因此，抑制SAH后的早期神經(jīng)炎癥反應(yīng)是減輕早期腦損傷的重要途徑，同時(shí)也是改善SAH預(yù)后的重要手段。

SIN是從傳統(tǒng)中草藥青風(fēng)藤根莖中提取的生物堿單體，其自身含有的酚羥基可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗炎、抗氧化等作用[12-13]。SIN可清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，從而緩解各種原因?qū)е碌钠鞴贀p傷[14]；此外，其在腦缺血性及出血性卒中和神經(jīng)退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。有研究證明，SIN可以減輕阿爾茨海默病中淀粉樣蛋白聚集導(dǎo)致的活性氧(reactive oxygen species,ROS)、活性氮(reactive nit rogen species，RNS)相關(guān)的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。而在腦梗死模型中，SIN預(yù)處理或者缺血后干預(yù)均可縮小梗死面積，改善預(yù)后[16-17]。本研究結(jié)果顯示，SAH+SIN組大鼠SAH后的腦組織水含量明顯低于SAH組，神經(jīng)功能評分明顯高于SAH組，表明SIN可明顯減輕SAH導(dǎo)致的腦水腫，從而改善顱內(nèi)壓，同時(shí)還可減輕SAH后的運(yùn)動(dòng)功能障礙，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明，SIN可減輕創(chuàng)傷性腦損傷后二次損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[18-19]。本課題組前期的研究結(jié)果表明，SIN可有效減輕創(chuàng)傷性腦損傷后線粒體凋亡，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，SIN可有效抑制NADPH氧化酶從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，還可抑制腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平及NF-κB的活性，減少ROS的產(chǎn)生，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21-22]。本研究結(jié)果顯示，與SAH組相比，SAH+SIN組NLRP3、IL-1β及TNF-α表達(dá)均明顯降低，且神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少，表明SIN可有效減輕SAH后的炎癥反應(yīng)，從而緩解早期腦損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其可能通過阻斷NLRP3的激活途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，SIN可明顯減輕SAH后的炎癥反應(yīng)，從而減輕早期腦損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。