李 蘭 陳 燕 張東方

1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063210；2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent pregnancy loss, RPL)是指連續(xù)發(fā)生3次或3次以上妊娠23周前的自然流產(chǎn)，大約影響到2%～5%的育齡夫婦[1]。2017 ESHRE報道約40%RPL屬于原因不明，而越來越多的證據(jù)指出原因不明的RPL可能與免疫因素有關(guān)[2]。免疫細(xì)胞對母體子宮蛻膜化與胚胎胎盤發(fā)育的調(diào)控是妊娠建立和維持的關(guān)鍵。影響其平衡調(diào)節(jié)因素較多，與細(xì)胞因子自身、生長因子以及特殊抗原表達(dá)均有關(guān)[3]。近期我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選出27個與RPL密切相關(guān)的差異蛋白，其中血漿激肽釋放酶敏感性糖蛋白-120(Plasma kallikrein sensitive glycoprotein 120, PK-120)是比較典型的差異蛋白之一。PK-120蛋白是924個氨基酸編碼的分布于血漿中的糖蛋白(glycoprotein)，隸屬于胰蛋白酶抑制劑(ITI)家族成員，其在C末端序列中含有激肽釋放酶緩激肽樣結(jié)構(gòu)域，即具有血漿激肽釋放酶敏感性。此外，前期研究表明在不同種類的疾病如乳房癌、卵巢癌、胰腺癌、糖尿病中可檢測到與疾病相關(guān)的有差異性的PK-120裂解片段，但其確切的分子機制并不清楚[4-6]。PK-120異常表達(dá)對妊娠免疫耐受的影響目前尚未見報道。因此，本研究利用人單核細(xì)胞(PBMC)、人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞系JEG3，探討 PK-120siRNA 對促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子(Th1/Th2)免疫應(yīng)答的影響，并結(jié)合基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察比較裂解片段PK-120(F.L.)、PK-120(T.R.)對免疫細(xì)胞增殖的影響。同時，利用共培養(yǎng)體系分析PK-120(T.R.)與妊娠免疫耐受的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明RPL發(fā)病機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對象 2018年1月～2020年1月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的原因不明RPL患者60例，自然流產(chǎn)≥3次。年齡(32.6±5.2)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI):(26.3±1.7)kg/m2；妊娠(5.3±2.6)次；生育(1.4±0.2)次；既往流產(chǎn)孕(7.8±1.0)周；繼發(fā)流產(chǎn)(3.6±0.8)次。均為早期流產(chǎn)者，夫妻雙方染色體核型正常、Rh血型一致，抗精子抗體陰性；患者子宮發(fā)育正常，無中、重度子宮內(nèi)膜異位；生殖激素正常，妊娠期無病毒感染及其他疾病史，無致畸環(huán)境接觸史和服藥史，無煙酒嗜好，家族無遺傳病史。同期收集30例健康女性作為對照組，年齡(31.9±4.5)歲；BMI:(24.8±2.5)kg/m2；妊娠(2.5±1.7)次；生育(1.8±0.6)次，均有正常生育史。受試者均有正常月經(jīng)周期，并在月經(jīng)周期排卵后5～9d收集血液樣本，靜脈血樣采集與保管方法如前期研究所述[7]。

1.2主要試劑 JEG3人絨毛膜癌細(xì)胞株(ATCC HTB-36)、THP-1人外周血單核細(xì)胞系(ATCC TIB-202)；RPL患者與對照組血清、PBMC；CD14磁珠分選CD14 + 細(xì)胞(MiltenyiBiotec, Germany)；高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL, USA)；胎牛血清(GIBCO BRP, USA)；質(zhì)粒DNA構(gòu)建及鑒定、建立過表達(dá) PK-120細(xì)胞株；BD CBA人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子試劑盒(BD Biosciences, USA)；兔PK-120多克隆抗體(sc-21987, USA)；鼠β-actin單克隆抗體(sc-25778, USA)鼠Flag單克隆抗體(Sigma, USA)；鼠Myc單克隆抗體(9E10, USA)；realtime PCR試劑盒, Lipofectamine 2000及RNAimax(Invitrogen, UK)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分離 JEG3細(xì)胞生長于DMEM培養(yǎng)液、PBMC與人THP1細(xì)胞生長于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。采集對照組新鮮外周血，采用Ficoll 密度梯度離心分離PBMC，并按照說明書純化CD14+細(xì)胞(Miltenyi Biotec，Germany)。

1.3.2質(zhì)粒DNA構(gòu)建及鑒定 建立過表達(dá)PK-120細(xì)胞株，采用全基因合成法合成PK-120基因的編碼區(qū)序列，克隆至帶pGEM-T Easy vector 的表達(dá)載體。設(shè)計合成引物，擴(kuò)增該基因克隆至pCS4-3Flag載體，采用Lipofectamine 2000、Amaxa cell line nucleofector kit V試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。pCS4-3Flag-PK-120(△BKD)的構(gòu)建利用Over-lapping PCR技術(shù)完成。采用Real-time PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光方法判斷PK-120高表達(dá)效果。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子的表達(dá) 多色流式細(xì)胞儀LSR Fortessa(BD Biosciences, USA)進(jìn)行檢測，利用BD FACSDivaTMsoftware調(diào)節(jié)儀器電壓、補償及獲取細(xì)胞樣品，每管獲取2 × 105個細(xì)胞。采用Flowjo 10.0對所得細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)說明書用BD CBA Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子試劑盒檢測PBMC及不同條件培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的活性。

1.3.4Western blot檢測 按照實驗設(shè)計進(jìn)行誘導(dǎo)干擾或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白，用BCA測定蛋白濃度后，以每個泳道30～50 μg上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。將膜放入不同濃度的抗體中(抗PK-120抗體以 1:200稀釋；抗Flag與抗 β-actin抗體分別以1:1000 稀釋)，4℃孵育過夜，二抗羊抗兔IgG-AP、羊抗鼠IgG-AP(1:5000稀釋)37℃孵育2h，BCIP/NBP顯色劑顯色1min。用Image J軟件(NIH, V2.1.4.7)對蛋白條帶測量光密度值，將目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參光密度值比作為該蛋白的相對表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.5Real-time PCR檢測 提取細(xì)胞總RNA測定純度及濃度，對目的基因進(jìn)行引物設(shè)計合成，見表1。根據(jù)說明書，SYBR?Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,USA)real-time PCR試劑盒用于DNA擴(kuò)增與檢測。

表1 目的基因引物序列

1.3.6RNA干擾實驗 使用Ambion SilencerTM針對PK-120基因設(shè)計2條siRNA并合成，其序列為#1; 5’-CGA ACC ACC CAU UUG AGA U-3’, #2; AUG UCU CGA UGG CAA GCA C-3’(Bioneer, Korea)。RNAimax、siRNA分別用Opti-MEM稀釋混合后轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，具體操作按照RNAimax試劑盒(Invitrogen, UK)。相同濃度的非靶向siRNA(sc-37007, USA)作為陰性對照組。

1.3.7細(xì)胞增殖實驗 采用CCK-8實驗進(jìn)行分析，將轉(zhuǎn)染24h、48h、72h的各組細(xì)胞密度調(diào)整5×103個/mL，加入CCK-8溶液10μL進(jìn)行培養(yǎng)，37℃ 孵育1～4h, 置于酶標(biāo)儀上450nm處對各孔吸光度值檢測3次，取其平均值為最終所測值，具體操作按照Cell counting kit-8(Dojindo Molecular Technologies, USA)進(jìn)行。

1.3.8體外共培養(yǎng)(co-culturing system)模型試驗 研究分為三組：JEG3細(xì)胞加入5%FBS、JEG3細(xì)胞加入5%對照組血清、JEG3細(xì)胞加入5%RPL患者血清[RPL患者組1和2為PK-120(T.R.)高表達(dá)的實驗組；RPL患者組3為PK-120(F.L.)與PK-120(T.R.)表達(dá)實驗組]共培養(yǎng)24h后，分析比較Th1/Th2、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9, MMP-9)、黏蛋白(MUC-1)、胎盤蛋白(placental protein 14, PP14)的分泌量。

2 結(jié)果

2.1RPL組和對照組Th1、Th2水平及PK-120 表達(dá) 采用Western blot法與ELISA法測定血清Th1、Th2含量及PK-120 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RPL患者血清PK-120(T.R.)裂解片段相對表達(dá)顯著增加，而對照組 PK-120(F.L.)增加，見圖1。RPL患者組血清中Th1(TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2)水平均高于對照組(P<0.05)，而Th2(IL-4、IL-10)的水平低于對照組(P<0.05)，見表2。進(jìn)一步分離RPL患者PBMC，發(fā)現(xiàn)PK-120 mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表3；但PK-120(T.R.)裂解片段高于對照組(P<0.01)，見圖2。RPL患者PBMC中Th1水平高于對照組，而Th2的水平卻明顯低于對照組(P<0.05)，見表3。

圖1 對照組與RPL組血清PK-120表達(dá)水平

表2 RPL組與對照組血清中細(xì)胞因子水平比較

表3 RPL組與對照組外周PBMC中細(xì)胞因子和PK-120 mRNA表達(dá)水平比較

圖2 對照組與RPL組PBMC中PK-120表達(dá)水平

2.2PK-120敲低的PBMC可增加Th1釋放 利用流式細(xì)胞儀檢測PK-120 敲低的人CD14+PBMC中的細(xì)胞因子的表達(dá)量，結(jié)果顯示，Th1表達(dá)水平顯著增高，而Th2顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組CD14+PBMC中細(xì)胞因子表達(dá)量的比較

2.3PK-120對JEG3人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中Th1、Th2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 RNA干擾沉默PK-120基因結(jié)果顯示與對照組相比，siRNA處理后JEG3細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-2表達(dá)量增加，而IL-4、IL-10、IL-13表達(dá)量減少，其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。分別將質(zhì)粒pCS4-3Flag-PK-120(F.L)、pCS4-3Flag-PK-120(T.R，aa689-902)、pCS4-3Flag-PK-120(△BKD，aa661-688)轉(zhuǎn)染至JEG3細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系并比較細(xì)胞因子的分泌量，見圖3。結(jié)果顯示：PK-120(F.L.)組與PK-120(T.R.)組相比，PK-120(T.R.)組可上調(diào)Th1(TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2)的表達(dá)，而PK-120(F.L.)組可明顯上調(diào)Th2(IL-4、IL-10)的表達(dá)(P<0.05)。與PK-120(F.L.)組相比，PK-120(△BKD)組Th2(IL-4及IL-10)水平明顯降低(P<0.05)；以Th1/Th2來反映免疫應(yīng)答方式，TNF-α/IL-10及IFN-γ/IL-10比率見表6。

表5 各組JEG-3人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)量的比較

圖3 Western blot檢測其構(gòu)建體的表達(dá)水平

表6 各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Th1、Th2細(xì)胞因子mRNA表達(dá)比較

2.4各組細(xì)胞增殖的比較 siPK-120轉(zhuǎn)染組可時間依賴性增加THP1單核細(xì)胞的增殖力, siRNA陰性組與對照組間細(xì)胞的增殖無顯著差異(P>0.05)；siRNA-PK-120組細(xì)胞的增殖較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表7。而PK-120(T.R.)組較PK-120(F.L.)組表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表8。Western blot檢測單個構(gòu)建體的表達(dá)水平見圖4。

表7 各組細(xì)胞增殖的比較

表8 各組轉(zhuǎn)染后CCK-8實驗結(jié)果的比較

圖4 Western blot檢測單個構(gòu)建體的表達(dá)水平

2.5共培養(yǎng)體系分析結(jié)果 為了進(jìn)一步明確PK-120與RPL發(fā)生機制之間直接的相關(guān)性，我們利用體外共培養(yǎng)模型以證明PK-120與妊娠免疫耐受關(guān)系及相關(guān)分子之間的交互作用。研究分為三組：JEG3細(xì)胞加入5%FBS、JEG3細(xì)胞加入5%對照組血清、JEG3細(xì)胞加入5%RPL患者血清[RPL組1和2為PK-120(T.R.)高表達(dá)的實驗組；RPL組3為PK-120(F.L.)與PK-120(T.R.)表達(dá)實驗組]共培養(yǎng)24h后，比較細(xì)胞因子分泌量與粘附分子表達(dá)量。相差顯微鏡下可見在RPL患者血清共培養(yǎng)組，滋養(yǎng)層細(xì)胞70%～80%死亡(錐蟲藍(lán)染色法確定)；同時，在對照組可觀察到“jelly coat”樣透明物質(zhì)生成(紅色箭頭)見圖5；RPL組Th1表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)(P<0.05)，見表9；共培養(yǎng)體系細(xì)胞中，RPL組MMP-9的表達(dá)量較對照組明顯增高(P<0.05)，MMP-2、MUC-1、PP-14的表達(dá)量明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表10。

圖5 各組人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞共培養(yǎng)(100×)

表9 各組共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子表達(dá)比較

表10 各組共培養(yǎng)體系中MMP-2、MMP-9、MUC-1及PP-14表達(dá)量的比較

3 討論

從免疫學(xué)角度看，同種免疫與母體及胚胎免疫耐受失衡相關(guān)，多表現(xiàn)為封閉抗體低下及共刺激途徑占優(yōu)勢，Th1與Th2的比值偏移[8]。妊娠進(jìn)程中，胎兒作為半同種自然移植物，只有母體對其免疫處于抑制狀態(tài)下能維持正常妊娠，在此期間母體會抑制T細(xì)胞反應(yīng)以阻止自身的排異反應(yīng)[9]。正常妊娠Th2占優(yōu)勢，當(dāng)Th1/Th2平衡向靠近Th1方向移動則會損害妊娠，導(dǎo)致流產(chǎn)[10]。本課題組前期研究鑒定了RPL有關(guān)基因及蛋白質(zhì)，其中>65%RPL患者PK-120 蛋白質(zhì)出現(xiàn)截斷形式(cleaved or truncation form)，但對這一現(xiàn)象的分子機制還不十分清楚。

PK-120與其他4個同源的重鏈及1條輕鏈共同編碼ITI家族分子。早期研究表明其與透明質(zhì)酸通過軟骨素硫酸橋十字共價連接，作為絲氨酸蛋白抑制酶類似物，是一種潛在的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)調(diào)節(jié)物[11]，在疾病發(fā)生過程中牢固地與透明質(zhì)酸相結(jié)合，從而轉(zhuǎn)變了自身的一些性質(zhì)，在炎癥和其他的生物過程中起調(diào)節(jié)作用[12-13]；由于具有對激肽釋放酶降解的敏感性，后來被認(rèn)為是一種血漿激肽釋放酶的酶底物，被稱為PK-120[5]。我們研究發(fā)現(xiàn)，對照組血清中有PK-120(F.L.)的表達(dá)，但是在RPL患者血清中，PK-120(T.R)裂解片段顯著上調(diào)；而PK-120在RPL患者PBMC中mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組。PK-120具有幾個推定的結(jié)構(gòu)域(putative domain)，包括信號肽、von villebrand因子A型結(jié)構(gòu)域(272-432aa)、富含脯氨酸的區(qū)域(611-730aa)、可變剪接結(jié)構(gòu)域(621-650aa)和緩激肽樣結(jié)構(gòu)域(Bradykinin-like domain, BKD，661-688 aa)。其中，富含脯氨酸的區(qū)域(PRR)內(nèi)有緩激肽樣片段(Pro662-Arg688)可參與急性期炎癥反應(yīng)[14-15]。另外，緩激肽樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)有血漿激肽釋放酶切割位點(R688)，我們的前期研究(LC-MS/MS)已經(jīng)鑒定了PK-120在RPL患者中切割位點[7]。在對domain功能研究中發(fā)現(xiàn)，BKD 區(qū)域在免疫應(yīng)答及RPL發(fā)病機制中可能具有重要作用。本次研究結(jié)果顯示，人CD14+單核細(xì)胞PK-120的敲除可以上調(diào)Th1的表達(dá)。進(jìn)一步實驗表明，在PK-120(T.R)過表達(dá)組Th1的表達(dá)增加，而在PK-120(F.L.)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Th2的表達(dá)增加。

為了更好的了解PK-120與RPL發(fā)病機制的相關(guān)性，我們分析上述共培養(yǎng)系統(tǒng)顯示，與對照組相比，RPL組共培養(yǎng)細(xì)胞中免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)降低，如PP-14和MUC-1。研究表明，這些因子在RPL患者的絨毛組織中異常表達(dá)[16]。大約有25%的RPL患者顯示出對滋養(yǎng)層的免疫反應(yīng)增強，炎性細(xì)胞相對增殖率顯著[17]。提示免疫抑制相關(guān)基因產(chǎn)物的異常調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致RPL。PP-14作為一種免疫抑制分子，可能參與阻止母體對早期胚胎的免疫反應(yīng)，對維持妊娠起重要作用。而粘附分子如MUC-1在附著及粘附、妊娠免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，可通過形成胞飲突(Pinopode)完成對滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。也有研究指出，MUC-1的表達(dá)下降可能會誘導(dǎo)超級生育能力(super-fertility)，并中斷胚胎自我選擇，這使得有缺陷的胚泡及胚胎能夠被植入，最終導(dǎo)致流產(chǎn)率增加[18-19]。另外，MMP-2和MMP-9被發(fā)現(xiàn)在妊娠早期直接或間接地參與了滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和粘附過程。在本研究中，共培養(yǎng)體系檢測結(jié)果顯示，RPL患者組MMP-2、MUC-1、PP-14均顯著低于對照組,而MMP-9表達(dá)量高于對照組; 對照組中“jelly coat” 樣透明物質(zhì)表型的形成可能與正常的免疫調(diào)節(jié)及妊娠免疫耐受或侵襲密切相關(guān)，且RPL共培養(yǎng)組細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子明顯上調(diào)，提示可能與妊娠過度炎癥反應(yīng)有關(guān)，導(dǎo)致Th1/Th2之間的平衡狀態(tài)被打破而發(fā)生RPL。

綜上所述，PK-120表達(dá)異?？缮险{(diào)促炎性細(xì)胞因子的分泌及免疫細(xì)胞增殖。PK-120(F.L.)可能在維持Th1/Th2平衡中起積極作用，而PK-120(T.R.)可能與妊娠免疫耐受及RPL發(fā)生機制有關(guān)。血清與PBMC中PK-120的檢測可能成為RPL診斷的評價指標(biāo)及分子治療潛在的靶點。但其作用與相關(guān)信號通路還需進(jìn)一步深入研究。