余 紅 樊志飛 徐佳楠 逯新坤

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063210

外傷痛是傷害性刺激作用于機(jī)體所引起的痛感覺(jué)及痛反應(yīng)，是一種復(fù)雜的生理、心理活動(dòng);有效緩解疼痛是臨床工作重點(diǎn)。楊梅樹皮，味苦、性溫，具有散瘀止血、止痛之功效，民間用于治療跌打損傷、骨折、痢疾、胃和十二指腸潰瘍、牙痛等[1]。五加皮可奏散風(fēng)祛濕、利水消腫、益肝腎壯筋骨之功效。臨床用于風(fēng)濕痹痛、筋骨拘攣、腰膝酸痛等證，適用于肝腎不足且有風(fēng)濕者，可單用浸酒服，也可與羌活、秦艽、威靈仙等配伍應(yīng)用。本研究旨在探討五加皮、楊梅樹皮制成的復(fù)方制劑(以下簡(jiǎn)稱復(fù)方制劑)抗炎和鎮(zhèn)痛效果，為進(jìn)一步臨床推廣運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，動(dòng)物證號(hào)：SCXK(京)2002-0005；昆明級(jí)SD健康小鼠，體質(zhì)量(28.72±3.07g),雌雄均可，動(dòng)物證號(hào)：SCXK(京)2002-0011；均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2藥品 用五加皮、楊梅樹皮濾液以2:5的比例制成復(fù)方制劑(由華北理工大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室煎制)。具體制作方法：將所需藥材稱重，溫水浸泡60min后加水(中藥：水比例為500g：1000mL)煮沸后保溫(120℃)，至濃縮液50mL。第二次加水至1000mL，再次煮沸后保溫，至濃縮液50mL。收集濾液，其濃度為1.56mg/g.mL。角叉菜膠由遼寧省藥物研究所生產(chǎn)(批號(hào)Carrageen,CAS 9000-07-1)。陽(yáng)性對(duì)照藥物采用吲哚美辛片(張家口市東風(fēng)制藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H13023005)。

1.1.3儀器 采用RB-200 智能熱板儀，秒表，電子天平(江蘇常熟市金羊砝碼儀器有限公司生產(chǎn))；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械、鐵籠、灌胃器、1mL注射器若干。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抗炎作用

1.2.1.1對(duì)小鼠耳殼炎癥的影響 昆明級(jí)SD健康小鼠50只隨機(jī)分成5組，每組10只，設(shè)空白對(duì)照組(0.9% NaCl注射液)、陽(yáng)性對(duì)照組(吲哚美辛0.01g/kg)及復(fù)方制劑低、中、高劑量組(0.88、1.56、3.12g/kg)。造模方法:二甲苯0.05mL/只,均勻涂于小鼠左耳前后兩面，3次/d，共3 d，導(dǎo)致急性炎癥；正常右耳作為對(duì)照。最后一次給藥1h后，用8mm直徑打孔器取圓耳片、稱重，以左耳片重減去右耳片重為左耳腫脹的重量，左右耳重之差作為腫脹度，將獲得數(shù)據(jù)分別計(jì)算出給藥組的腫脹抑制率=(對(duì)照組腫脹度-給藥組腫脹度)/對(duì)照組腫脹度×100%)。各劑量組結(jié)果分別與空白對(duì)照組、吲哚美辛組進(jìn)行對(duì)比。

1.2.1.2對(duì)大鼠角叉菜膠性關(guān)節(jié)腫脹的影響 Wistar大鼠50只隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄均可，分為空白對(duì)照組、吲哚美辛組及復(fù)方制劑低、中、高劑量組(劑量同上)。傷口涂抹給藥,3次/3的,共3d。于末次給藥后1 h各鼠左踝關(guān)節(jié)注射1%角叉菜膠0.1mL致炎，分別于致炎前及致炎后1、2、4、6、8 h測(cè)量大鼠左踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，求出各組的腫脹值。造模成功24h后，肉芽組織開(kāi)始形成，將肉芽組織放入4%多聚甲醛固定液中、石蠟包埋、切片、HE染色, 于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2復(fù)方制劑對(duì)大鼠外傷痛的影響 Wistar雌性大鼠隨機(jī)分組，每組大鼠均進(jìn)行體表編號(hào)進(jìn)行熱板法應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。室溫在15～20℃時(shí)，800mL燒杯預(yù)熱10min后，分別將大鼠放入燒杯中，記錄大鼠自置于燒杯中至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間(s)作為該鼠的痛閾值,剔除舔后足時(shí)間<5s或>30s或跳躍者。將合格大鼠隨機(jī)分為5組重復(fù)測(cè)定其正常痛閾值，取兩次正常痛閾平均值作為其給藥前痛閾值；然后分別灌胃給予吲哚美辛(0.01g/kg)、復(fù)方制劑(高、中、低劑量)，給藥量0.4～0.8mL/100g(根據(jù)不同藥物的毒性給藥量有所差異，但均<2mL/只)，對(duì)照組給予等量0.9%NaCl注射液，1次/d，連續(xù)7d。第8d給藥后15、30、60min分別測(cè)大鼠痛閾值，如60s仍無(wú)反應(yīng)，其痛閾以60s計(jì)算，以痛閾提高值(給藥后痛閾值減去給藥前痛閾值)進(jìn)行組間比較其顯著性。

1.2.3復(fù)方制劑對(duì)大鼠機(jī)體免疫功能的影響 另選熱板法應(yīng)激實(shí)驗(yàn)合格大鼠50只，各組均于應(yīng)激前0.5h給予相應(yīng)藥物灌胃，給藥量同上；1次/d，連續(xù)6d。末次給藥并測(cè)量扭體頻數(shù)后頸椎脫臼法處死并稱重、斷頭取血,采用放射免疫法測(cè)定血清糖皮質(zhì)激素含量, 形態(tài)法檢測(cè)自然殺傷細(xì)胞活性。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠耳殼腫脹度和腫脹抑制率比較 吲哚美辛及高、中劑量復(fù)方制劑均能明顯抑制二甲苯引起的小鼠耳殼炎癥，小鼠耳殼腫脹度均降低，腫脹抑制率均升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.830、3.354，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方制劑藥對(duì)二甲苯引起小鼠耳殼炎癥的影響(n=10)

2.2復(fù)方制劑對(duì)大鼠角叉菜膠樣踝關(guān)節(jié)腫脹抑制率的影響 吲哚美辛及復(fù)方制劑中、高劑量均能明顯抑制角叉菜膠所致的踝關(guān)節(jié)腫脹，藥效維持8h；與對(duì)照比較，各組給藥2h、4h、6h、8h的腫脹抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.606、6.186、6.706、5.136，P<0.05)，且復(fù)方制劑對(duì)腫脹度的影響呈劑量依賴性。見(jiàn)表2，圖1。

表2 各組大鼠抗角叉菜膠樣踝關(guān)節(jié)腫脹比較

圖1 各組大鼠抗角叉菜膠樣踝關(guān)節(jié)腫脹比較

2.3復(fù)方制劑對(duì)炎癥后肉芽組織生長(zhǎng)的影響 角叉菜膠致炎后4～6h，血腫與滲出液開(kāi)始凝結(jié)成塊。復(fù)方制劑高劑量組大鼠24h左右由傷口周圍長(zhǎng)出新生的毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞，即肉芽組織開(kāi)始形成，與對(duì)照組比較毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞明顯增多。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 對(duì)照組肉芽組織增生(100×) 圖3 復(fù)方制劑高劑量組肉芽組織增生(100×)

2.4復(fù)方制劑藥對(duì)大鼠疼痛的影響 與對(duì)照組比較，吲哚美辛及復(fù)方制劑藥中、高劑量均能明顯延長(zhǎng)痛閾時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.029，P<0.01)。復(fù)方制劑各組外傷痛抑制率隨劑量升高而提高，且與吲哚美辛組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.812，P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方制劑藥對(duì)小鼠抗外傷痛效果的影響

2.5復(fù)方制劑藥對(duì)小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的影響 與對(duì)照組比較，吲哚美辛組、復(fù)方制劑各劑量組血清糖皮質(zhì)激素水平明顯升高，自然殺傷細(xì)胞活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.224、7.195,P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血清糖皮質(zhì)激素含量及脾臟自然殺傷細(xì)胞活性的比較

3 討論

3.1復(fù)方制劑對(duì)角叉菜膠所致腫脹的效果 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示五加皮、楊梅樹皮復(fù)方制劑具有抑制腫脹和使毛細(xì)血管通透性降低的作用。根據(jù)炎癥不同時(shí)期的病理特點(diǎn)，本研究所選模型為二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，以局部血管擴(kuò)張和增加血管通透性為主要特征。結(jié)果表明：五加皮、楊梅樹皮復(fù)方制劑各劑量組對(duì)二甲苯誘發(fā)小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用。即不僅對(duì)以血漿蛋白滲出為主的急性炎癥有較好的對(duì)抗作用，而且對(duì)以肉芽組織增生為主的慢性增殖性炎癥也有顯著的抑制作用[2]，其作用機(jī)理可能與其具有的益氣活血、改善局部血液循環(huán)、減少炎性介質(zhì)釋放有關(guān)。

3.2對(duì)急性外傷痛的鎮(zhèn)痛效果 本研究顯示吲哚美辛及復(fù)方制劑藥中、高劑量均能明顯延長(zhǎng)痛閾時(shí)間。有報(bào)道五加皮對(duì)骨折、肥大性腰椎炎、腰椎管狹窄癥等有一定鎮(zhèn)痛效果[2]。楊梅樹皮中的黃酮、楊梅素[3-4]可降低血糖、抑制酪氨酸酶、拮抗血小板活化因子、保護(hù)肝臟，同時(shí)還具有抗抑郁和抗焦慮等作用[5-8]。因此，二者的復(fù)方制劑可有效治療急性閉合軟組織損傷、挫傷等，共奏抗炎鎮(zhèn)痛之功效，并可起鎮(zhèn)靜作用。

3.3對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能影響 脾臟是機(jī)體細(xì)胞、體液免疫的主要器官，含大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，占全身淋巴組織總量的25%。有實(shí)驗(yàn)研究表明, 楊梅樹皮含有的黃酮類化合物，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老作用，其作用機(jī)制與其抗自由基或抗氧化有關(guān)，雙氫楊梅樹皮素能顯著提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和溶血素含量，增強(qiáng)免疫功能，可提高小鼠的抗炎、鎮(zhèn)痛能力[8-9]。因此，用楊梅樹皮可提高機(jī)體免疫功能。活血、止痛、消腫是五加皮的重要作用，溫經(jīng)脈、止痛活血，對(duì)跌打損傷以及骨折和關(guān)節(jié)腫痛都有很好治療作用。同時(shí)五加皮滋補(bǔ)氣血、調(diào)節(jié)機(jī)體紊亂，明顯提高耐缺氧能力；具有補(bǔ)中、益精、祛風(fēng)濕,壯筋骨、活血去瘀等功能，久服“輕身耐勞”。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組與復(fù)方制劑各劑量組大鼠比較血清糖皮質(zhì)激素明顯降低、自然殺傷細(xì)胞活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述：①五加皮、楊梅樹皮復(fù)方制劑與西藥吲哚美辛對(duì)急性外傷痛的鎮(zhèn)疼效果相當(dāng)；尤其適用于肌肉外傷痛。②楊梅樹皮有鎮(zhèn)痛效果，五加皮有抗炎、鎮(zhèn)靜等藥效；復(fù)方制劑可協(xié)助免疫器官提高機(jī)體對(duì)炎癥的免疫防御能力。③五加皮、楊梅樹皮復(fù)方制劑具有直接的抗炎功效。④其藥理作用途徑可能是參與HPA調(diào)節(jié)[9]。