劉智君，徐 錦，梁志敏，楊慧瑜，陳玉蓮

（玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，廣西 玉林 537000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）一種常見的腎臟微血管損傷并發(fā)癥，腎臟組織長期處于高血糖的環(huán)境中，因氧化應激反應而使腎組織受損，出現(xiàn)腎功能障礙[1]。由于糖尿病是一種終身的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，故糖尿病患者后期多會出現(xiàn)DN并發(fā)癥。目前對糖尿病腎病的治療手段及藥品不多，主要為患者出現(xiàn)腎功能不全或障礙后，在控制患者血糖的同時給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和鈣拮抗劑進行綜合的調(diào)節(jié)[2]。因此，探索出治療DN的藥物對DN的防治具有十分重要的現(xiàn)實意義。

滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl為生長于云南的百合科黃精屬植物的干燥根莖，是《中華人民共和國藥典》規(guī)定作為黃精使用的3種原生藥之一，具有養(yǎng)陰潤肺、補脾益氣的功效。滇黃精的主要成分為多糖、甾體皂苷、黃酮等物質(zhì)，具有增強免疫力、降血糖、降血脂等藥理作用[3]。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）對胰腺組織的損傷程度會隨其濃度的增大而增大，高濃度的STZ易徹底造成胰腺組織喪失胰島素分泌能力，而形成1型糖尿病模型。而低濃度STZ可誘導2型糖尿病的形成并隨著時間的推移及病情的發(fā)展，出現(xiàn)糖尿病腎病的并發(fā)癥。本研究采用低濃度鏈脲佐菌素多次誘導的糖尿病小鼠構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型，探討滇黃精多糖對DN小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（桂）2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于通風良好的環(huán)境，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)。本研究嚴格按動物倫理要求進行研究實驗。

1.2 藥物與試劑藥材滇黃精由廣西醫(yī)科大學藥學院中藥教研室朱丹副教授鑒定為百合科黃精屬植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl的干燥根莖。滇黃精多糖由本實驗室采用“水提醇沉法”制備所得。纈沙坦片（海南皇隆制藥股份有限公司，批號：180125）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號：B1857）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（晶美生物工程有限公司，批號：20190117）；白介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（晶美生物工程有限公司，批號：20181229）；白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（晶美生物工程有限公司，批號：20190115）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：B1903C）；纖維連接蛋白（FN）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：B1901D）。

1.3 主要儀器羅氏卓越型血糖儀（瑞士ACCU-CHEK Performa）；7100型全自動血生化分析儀（日本HITACHI）；H-7650型透射電鏡（日本HITACHI）；9602A酶標儀（北京艾普生設備有限公司）。

1.4 造模與分組50只雄性小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將小鼠禁食不禁水12 h，用4℃的枸櫞酸緩沖液（pH=7.4）所溶解的STZ溶液，對50只昆明種小鼠進行尾靜脈注射STZ（40 mg/kg，STZ配制后需2 min內(nèi)用完，超2 min的藥物不留存使用），1次/d，連續(xù)注射3 d[4]。末次注射1周后，檢測小鼠空腹血糖（FBG），以FBG≥11.1 mmol/L為糖尿病小鼠，繼續(xù)予高脂高糖飲食飼料喂養(yǎng)90 d。通過檢測小鼠24 h尿量、尿蛋白腎功能指標驗證其損傷的存在，糖尿病腎病小鼠模型形成。將成模的小鼠隨機分為模型組，纈沙坦組和滇黃精多糖低、中、高劑量組，每組10只。另取10只健康昆明種雄性小鼠設為空白對照組。

1.5 實驗給藥纈沙坦組小鼠灌胃予生理鹽水配制的纈沙坦混懸液，20 mg/kg；滇黃精多糖低、中、高劑量組小鼠分別灌胃予生理鹽水配制的滇黃精多糖混懸液，劑量分別為120、240、480 mg/kg；空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水；1次/d，連續(xù)給藥90 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 空腹血糖及尿蛋白檢測 末次給藥1 d后，采集小鼠尾部末端血液，用血糖儀檢測小鼠FBG；通過代謝鼠籠的尿漏斗裝置收集各組小鼠尿液后，統(tǒng)計各組小鼠尿量，并采用全自動血生化分析儀將收集到的尿液進行24 h尿蛋白（UP）含量檢測。

1.6.2 腎功能檢測 小鼠拔眼球取血法取血，每只小鼠取0.8～1 mL血液，3 500 r/min高速低溫離心機分離10 min，吸取上層血清存放于-80℃環(huán)境中備用。按試劑盒說明書操作測定血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量。

1.6.3 病理及超微組織觀察 切取小鼠右側(cè)少部分腎臟，置于10%福爾馬林溶液中滲透固定。制蠟塊，切片脫蠟，依次對標本使用二甲苯、無水乙醇、酒精、蒸餾透化及洗滌，HE染色法對其進行染色，觀察糖尿病腎病小鼠腎臟的病理學變化。另切取小鼠右側(cè)少部分腎臟，置于2.5%戊二醛溶液中滲透固定，制片，采用透射電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6.4 炎癥因子及纖維化因子檢測 將剩余的右側(cè)腎臟組織與左側(cè)腎臟組織一起制備成勻漿液后，采用ELISA法，按說明書操作分別檢測腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量及纖維化因子TGF-β1、FN的含量。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進一步采用Bonferroni法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠24 h尿量、尿蛋白含量比較模型組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量明顯高于空白對照組（P＜0.01）；纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；滇黃精多糖中、低劑量組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量明顯高于纈沙坦組（P＜0.05或P＜0.01）；滇黃精多糖高劑量組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量高于纈沙坦組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠24 h尿量、尿蛋白含量比較（±s）

表1 各組小鼠24 h尿量、尿蛋白含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與纈沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）24 h尿量（mL）尿蛋白（mg/24 h）空白對照組 10 - 0.41±0.04 0.35±0.03模型組 10 - 2.07±0.18b 4.76±0.52b纈沙坦組 10 20 0.69±0.11d 1.17±0.12a d滇黃精多糖高劑量組10 480 0.71±0.09a d 1.21±0.16b d滇黃精多糖中劑量組10 240 1.05±0.23a d e 1.96±0.31b d e滇黃精多糖低劑量組10 120 1.74±0.17b c f 2.84±0.44b d f

2.2 各組小鼠血清中Scr、BUN含量比較模型組小鼠血清中Scr、BUN含量明顯高于空白對照組（P＜0.01）；纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠血清中Scr、BUN含量明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；滇黃精多糖中、低劑量組小鼠血清中Scr、BUN含量明顯高于纈沙坦組（P＜0.05或P＜0.01）；滇黃精多糖高劑量組小鼠血清中BUN含量低于纈沙坦組（P＜0.05），但Scr含量與纈沙坦組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠血清中Scr、BUN含量比較（±s，mg/dL）

表2 各組小鼠血清中Scr、BUN含量比較（±s，mg/dL）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與纈沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）Scr BUN空白對照組 10 - 0.21±0.05 13.18±1.12模型組 10 - 0.64±0.08b 34.52±2.18b纈沙坦組 10 20 0.32±0.04a 19.49±1.93a滇黃精多糖高劑量組 10 480 0.31±0.05d 16.54±1.85ade滇黃精多糖中劑量組 10 240 0.46±0.04ace 24.83±2.67bce滇黃精多糖低劑量組 10 120 0.52±0.07ace 28.55±2.51bcf

2.3 各組小鼠空腹血糖比較給藥前，模型組、纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠空腹血糖明顯高于空白對照組（P＜0.01）。給藥后，模型組、纈沙坦組小鼠空腹血糖值增加；滇黃精多糖高、中劑量組小鼠空腹血糖值下降（P＜0.05）。與纈沙坦組比較，滇黃精多糖高劑量組小鼠血糖明顯下降（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠空腹血糖比較（±s，mmol/L）

表3 各組小鼠空腹血糖比較（±s，mmol/L）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與纈沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量(mg/kg) 給藥前 給藥后空白對照組 10 - 7.24±1.08 7.44±1.63模型組 10 - 16.28±2.73b 21.52±3.52b e纈沙坦組 10 20 16.47±2.34b 18.48±3.68b c滇黃精多糖高劑量組10 480 16.56±2.05b 12.79±3.83b d e滇黃精多糖中劑量組10 240 16.42±2.41b 15.72±2.49b c e滇黃精多糖低劑量組10 120 16.01±1.97b 17.35±2.15b c

2.4 各組小鼠腎臟的病理學觀察HE染色結(jié)果顯示，空白對照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整飽滿，細胞形態(tài)正常，組織中未有空泡出現(xiàn)，腎臟的包曼氏囊腔飽滿；模型組小鼠腎小球空泡較多，細胞變形且有炎性細胞浸潤，包曼氏囊腔呈皺縮變??；纈沙坦組小鼠腎組織空泡數(shù)量少且空泡較少，輪廓較飽滿；滇黃精多糖各劑量組小鼠腎組織細胞變形有所緩解，腎小球結(jié)構(gòu)相對完整，少有空泡出現(xiàn)，炎性細胞浸潤減少，包曼氏囊腔輪廓皺縮程度減少。（見圖1）

圖1 各組小鼠腎臟的病理學觀察（HE，×400）

2.5 各組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化情況透射電鏡觀察結(jié)果顯示，空白對照組小鼠腎小球基底膜無融合、增生、增厚現(xiàn)象，足突清晰且數(shù)量較多；模型組小鼠腎小球中基底膜增厚且融合現(xiàn)象明顯，腎小球系膜增寬，足突數(shù)量較少；纈沙坦組小鼠基底膜融合現(xiàn)象少，足突數(shù)量較模型組多；滇黃精多糖各劑量組小鼠腎小球基底膜融合增厚得到緩解，足突數(shù)量有所增加。（見圖2）

圖2 各組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化（×15 000）

2.6 各組小鼠腎臟中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量比較模型組小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯高于空白對照組（P＜0.05）；纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠腎組織TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均低于模型組（P＜0.01）；滇黃精多糖中、低劑量組小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯高于纈沙坦組（P＜0.01），滇黃精多糖高劑量組小鼠TNF-α含量低于纈沙坦組（P＜0.05），而IL-1β、IL-6含量低于纈沙坦組，但差異無統(tǒng)計學意義。（見表4）

表4 各組小鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（±s，ng/L）

表4 各組小鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（±s，ng/L）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與纈沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg） TNF-α IL-1β IL-6空白對照組 10 - 65.61±5.76 6.09±1.42 11.95±1.69模型組 10 - 127.22±6.29b 14.27±2.78b 51.08±3.75b纈沙坦組 10 20 80.74±6.47bd 8.29±1.51bd 20.84±1.22bd滇黃精多糖高劑量組10 480 76.23±5.42bde 8.14±1.84ad 19.75±1.49bd滇黃精多糖中劑量組10 240 92.75±7.38bdf 10.85±2.09bdf 31.82±2.51bdf滇黃精多糖低劑量組10 120 105.91±8.14bdf 12.76±2.63bcf 40.78±2.37bdf

2.7 各組小鼠腎臟中纖維化因子TGF-β1、FN含量比較模型組小鼠腎組織中TGF-β1、FN的含量明顯高于空白對照組（P＜0.01）；纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠腎組織中TGF-β1、FN的含量均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；滇黃精多糖中、低劑量組小鼠腎組織TGF-β1、FN的含量明顯高于纈沙坦組（P＜0.05或P＜0.01），滇黃精多糖高劑量組小鼠腎組織中TGF-β1、FN含量低于纈沙坦組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組小鼠腎臟中TGF-β1、FN的含量比較（±s，ng/mL）

表5 各組小鼠腎臟中TGF-β1、FN的含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與纈沙坦組比較，eP＜0.05，fP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）TGF-β1 FN空白對照組 10 - 1.27±0.09 3.98±0.64模型組 10 - 4.85±1.23b 6.17±0.57b纈沙坦組 10 20 2.74±0.65b d 4.38±0.85b d滇黃精多糖高劑量組 10 480 2.39±0.72a d 4.19±0.72b d滇黃精多糖中劑量組 10 240 3.24±0.79b d e 4.86±1.01b d e滇黃精多糖低劑量組 10 120 3.95±0.81a c f 5.47±0.94a c f

3 討 論

糖尿病腎?。―N）是因糖尿病血糖不穩(wěn)定，長期處于高血糖狀態(tài)下導致腎臟微血管受損的并發(fā)癥。由于高血糖對腎臟的損傷需要較長的時間，DN一般高發(fā)于糖尿病后期患者，且會發(fā)展為終末期腎臟疾病，這也是糖尿病致死、致殘的主要影響因素[5-7]。由于DN的發(fā)病漫長且發(fā)病機制復雜，目前對其治療的藥物較少，故研發(fā)新的治療DN的藥物具有重要意義。

腎臟組織中巨噬細胞大量分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6[8-9]。在DN的發(fā)病機制中，炎癥細胞的浸潤及巨噬細胞自分泌出的炎癥因子對腎臟的損傷起著關鍵的作用[10-11]。高血糖所引起的氧化應激反應，將進一步加重腎組織的炎癥反應而加重腎臟的損傷，并啟動腎組織中腎間質(zhì)纖維化的進程，使纖維化因子TGF-β1、FN被活化，從而加速腎間質(zhì)纖維化的進程[12-14]。

前期的研究中已證實滇黃精多糖具有良好的降血糖藥理學效果[15]。本實驗結(jié)果顯示滇黃精多糖可降低糖尿病小鼠的血糖，同時能降低小鼠尿液中尿蛋白的含量及緩解小鼠多尿的情況。滇黃精多糖干預后，糖尿病腎病小鼠血清中Scr、BUN的含量下降，表明糖尿病腎病小鼠腎功能情況有所恢復。滇黃精多糖干預下，糖尿病小鼠腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和纖維化因子TGF-β1、FN的含量均有不同程度的降低。HE染色結(jié)果及透射電鏡觀察表明，糖尿病腎病小鼠在滇黃精多糖干預后，腎組織細胞變形有所緩解，腎小球結(jié)構(gòu)相對完整，少有空泡出現(xiàn)，炎性細胞浸潤減少，包曼氏囊腔輪廓皺縮程度減少，基底膜融合增厚得到緩解，足突數(shù)量有所增加。提示滇黃精多糖能有效地調(diào)節(jié)糖尿病腎病小鼠血糖，同時提高腎組織功能，緩解腎臟的受損情況。其作用機制可能為降低腎臟組織中炎癥因子的含量，緩解腎臟組織中炎癥反應，同時降低纖維化因子的含量，阻止腎間質(zhì)纖維化進程的發(fā)生，從而達到緩解腎臟的受損情況，保護腎臟的作用。